[发明专利]一种简便的植物BY-2细胞冷冻保存方法

说明书

技术领域

本发明属于植物细胞冷冻保存复苏技术领域，具体涉及一种模式植物烟草的愈伤组织的超低温冷冻保存方法。

背景技术

烟草(tobacco)是茄科(Solanaceae)烟草属(Nicotiana tabacum)一年生草本植物，大约有60多种。烟草的特点是易于进行组织培养、容易得到转化植株而成为典型的模式植物，与拟南芥同被誉为植物界的“果蝇”，在技术应用中，其可作为生物反应器，生产抗癌的基因产物，然后利用生物技术予以提取，用于医学治疗。另外，烟草在开发食品和药物资源方面的诸多潜在用途将会不断地被发现、利用。因此，通过组织培养得到烟草细胞具有重要医学研究价值。其种质资源的保存和保护是科研人员所面临的一个重要难题。这是因为细胞的传代是有限制的，长期连续传代的细胞不仅消耗大量的人力和物力，而且细胞的生长于形态等会有一定退变或转化，因而细胞失去原有的遗传特性，有时还会由于细胞污染而造成传代中断，种质丢失。因此，在实际工作中常需要冻存一定数量的细胞，以备替换备用。关于烟草愈伤组织的冷冻保存方法尚未见报道，因此找到一种简单易行且高效率的冷冻保存方法显得十分重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种烟草愈伤组织的冷冻保存方法，通过对冻存过程中影响细胞存活率的因素的分析和提高资源利用率等方面考虑，实验得出了一套超低温保存烟草愈伤组织的方法，该方法简单易行，冻存后的细胞有较高的存活率，丰富了超低温保存的方法，对其他植物种类的愈伤组织的超低温保存也提供了一定的参考。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

首先对取得的烟草叶片愈伤组织进行预培养使其获得良好的生长状况，然后在冷冻保护剂存在下，将烟草愈伤组织细胞液在4℃，-20℃，-40℃依次处理，最后于-80℃保存备用，取出时采用快速融化法37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1min内全部融化冷冻细胞液，离心去上清液后换入新鲜培养基进行培养即可使用。

具体步骤如下：

预培养：将烟草叶片的愈伤组织在含8％的蔗糖液体培养基中预培养5d；

冷冻保护剂的预处理：将预培养后的细胞悬浮液4℃800rpm离心5min，吸去上清液后保留2ml细胞液转移至冷冻保藏管中，然后在保留的细胞液中加入冷冻保护剂，密封；

加入冷冻保护剂的方式：50％山梨醇0.572ml、二甲基亚砜0.286ml、细胞悬浮液2ml，其中，山梨醇经过高压蒸汽灭菌，二甲基亚砜经过紫外灯灭菌；

降温冷冻程序：采用分步冷冻法：将预处理后的材料降温至4℃下静置预处理30min，再在-20℃，停留30min，再-40℃，静置3h，最后将处于冷冻保藏管中的细胞放置-80℃中保存；

冷冻保藏后的细胞复苏培养步骤：

(1)取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉；

(2)将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70％酒精并擦拭容器以灭菌，移入无菌操作台内；

(3)取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1min内全部融化，以70％酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内；

(4)取出解冻的细胞悬浮液，缓缓加入有培养基的培养容器内，稀释比例为1∶10，混合均匀，放入培养箱培养；

(5)在解冻培养后隔日更换培养基。

本发明所用的二甲基亚砜(DMSO)是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减少自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。保护剂一般使用甘油或二甲基亚砜，该物质分子量小，溶解度大，容易穿透细胞，其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而使冰点下降和保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩，且对细胞无明显毒性。目前DMSO的应用比甘油更为广泛，但要注意的是，DMSO在常温下对细胞的毒性作用较大，而在4℃时，其毒性作用大大减弱，且仍能以较快的速度渗透到细胞内。