[发明专利]一种猪瘟活疫苗效力检验方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种猪瘟活疫苗效力检验方法。

背景技术

猪瘟(Classical Swine fever,简称CSF)又称为猪霍乱(Hog cholera)或欧洲型猪瘟(European swine fever)，是一种猪急性或超急性发热的病毒传染性疾病，临床上的特征是散播迅速、发烧，解剖检验时可看到典型的出血病变。猪瘟可感染各种年龄的猪只，一年四季流行，发病率和死亡率均高，对猪危害极大。本病是威胁养猪业最重要的传染病之一。世界动物卫生组织(OIE)将猪瘟列为A类16种法定传染病之一，中国则定为一类烈性传染病。许多国家和地区使用猪瘟活疫苗强制接种免疫，也是目前防治猪瘟的最佳方法。

目前，我国生产猪瘟活疫苗效力检测方法都是采用兔体反应热方法。不仅需要很多试验大白兔，费时又费力，而且由于我国纯系大耳白兔的逐渐减少和品系越来越杂，导致现如今很难用兔体反应热来准确检测活疫苗的效力。

发明内容

鉴于此，本发明提供一种新的猪瘟活疫苗效力检验方法，具体地说，通过用间接免疫荧光(IFA)方法检测活疫苗在传代细胞中病毒含量来评价活疫苗的效力，替代传统的兔体反应热方法，以达到快速准确、简单有效的检测出猪瘟活活疫苗效力的目的。

本发明提供了一种猪瘟活疫苗效力检验方法，包括如下步骤：

(1)准备传代细胞

将长满单层的细胞，用EDTA-胰酶消化分散，得到传代细胞悬液；

(2)猪瘟活疫苗在传代细胞中的病毒含量测定

用细胞维持液将冻干猪瘟活疫苗回溶并稀释，将活疫苗稀释液和步骤（1）中细胞悬液加入细胞培养板中，置于培养箱中培养，同时设立不接毒正常细胞对照；

(3)间接免疫荧光(IFA)方法检测步骤（2）所得细胞中病毒含量

①将细胞培养板从培养箱中取出，弃去培养板孔内液体，用PBS洗涤；

②加入丙酮水溶液固定；

③弃去丙酮水溶液，用PBS洗涤；

④加入PBS稀释的猪瘟阳性血清(一抗)；

⑤弃去一抗，PBS洗涤；

⑥加入PBS稀释的FITC标记兔抗猪IgG(二抗)；

⑦弃去二抗，用PBS洗涤，最后加入PBS保存；

⑧置于荧光显微镜下观察荧光情况，判定猪瘟活疫苗效力。

较佳的，步骤(1)中在细胞板中加入细胞悬液的同时，加入步骤(2)中经稀释的猪瘟活疫苗液。

较佳的，步骤(2)中所述猪瘟活疫苗稀释是在0-8℃低温环境下进行。

较佳的，步骤(2)中培养箱是CO₂培养箱，温度为36-37℃，CO₂含量为2.5%-5%，培养时间为2-5天。

较佳的，步骤(3)中PBS洗涤的次数为2-7次。

较佳的，步骤(3)中丙酮水溶液温度为0-8℃，浓度为30%-90%。

较佳的，步骤(3)中一抗的稀释倍数选择范围为50-1000倍，二抗的稀释倍数选择范围为50-10000倍。

优选的，步骤（3）中一抗的稀释倍数是400倍，二抗的稀释倍数是500倍。

与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

1.检测时间短，只需要3天，而通常用兔体感染剂量检测至少需要11天。

2.用细胞感染病毒，操作简单，成本低，不需要买大量的实验动物，同时不需要专人测定实验动物体温。

3.利用细胞感染病毒，条件均一、稳定，不会出现实验动物个体差异而引起的实验结果差异显著。

具体实施方式

实施例1

猪瘟活疫苗效力检验方法

1.准备传代细胞

将长满单层的猪睾丸(ST)细胞（来源于ATCC，美国典型菌毒种保藏中心），用0.25%的胰酶(含0.02%的EDTA)消化分散后加入含3%胎牛血清的α-MEM细胞维持培养液，细胞计数后，将细胞悬液加入到96孔细胞板中，每孔100μl。

2.猪瘟活疫苗的稀释

本实施例制备了三批活疫苗，并分别测定了其抗原含量。