[发明专利]基于电化学-DNA反应控制芯片的酸碱法扩增DNA片段技术

说明书

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，具体地，本发明涉及一种基于通过溶液pH值控制双链核酸变性-复性过程的核酸扩增方法。

背景技术

PCR技术在生命科学实验和生物分子检测等领域广泛使用，对生命科学的发展产生了难以估量的推动作用。由于其待扩增核酸样品制备简单、样品需要量少、操作简单、扩增过程完全自动化而逐步运用到相关领域。近些年来，在病理学检验、疾病早期预警、流行病病毒分离、考古、法医物证学等诸多领域中，PCR技术都有非常精彩的应用。

由于PCR技术具有高度的不可替代性，PCR技术从诞生之时起就处于不断发展、不断创新之中。当前的PCR技术从温度的变化入手，通过控制DNA分子在不同温度下所进行的变性、复性和延伸过程，施加DNA复制所必需的各种碱基、引物、无机离子、缓冲液和DNA聚合酶，完成DNA分子的高保真度扩增。但是，这一方法具有明显的局限性。其一，每一个循环PCR反应都涉及温度的大幅度变化，由于温度变化是一个缓慢的过程，所以整个PCR的反应时间至少需要2小时。其二，每一个循环中，反应温度都在94-36-72摄氏度的区间内往复变化，电能消耗量高。因此，现行PCR的使用成本也相对较高。电能消耗量高的另一个副作用是对环境的损害。其三，除了实时定量PCR，常规的PCR反应无法对反应过程进行监控，无法对DNA扩增的效果进行及时的干预。上述不足之处制约了PCR技术的进一步发展，是PCR更广泛使用的瓶颈之一。

综上所述，本领域尚缺乏一种耗能低，反应时间短，可及时干预的PCR技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过调节体系酸碱性控制双链核酸变性-复性过程的方法。

本发明的另一目的是提供一种简便、高效率、能够在常温下进行的PCR技术。

本发明的第一方面，提供了一种扩增核酸的方法，所述方法包括：

(1a)变性步骤：在pH10-14的碱性条件下，使得扩增体系中的双链核酸分子解链；

(1b)复性和延伸步骤：在pH5-8的中性和近中性条件下，使得扩增体系中的单链核酸分子与引物进行复性，和在核酸聚合酶存在下，使结合于的单链核酸分子的引物进行延伸，形成扩增的双链核酸分子。

在另一优选例中，所述方法包括重复上述步骤(a)、(b)至少15～60次，较佳地20～45次。

在另一优选例中，在步骤(a)、和/或(b)中，反应温度为10～70℃；较佳地，反应温度为15～45℃。

在另一优选例中，在整个扩增过程中，扩增体系的温度维持在10～70℃；较佳地，15～45℃。

在另一优选例中，步骤(a)中所述pH较佳为11.5-12.5。

在另一优选例中，步骤(b)中所述pH较佳为6.5-7.5。

各步骤中，时间的优选范围如下：步骤(a)＞20秒，步骤(b)＞60秒。

步骤(a)较佳的20-120s，更佳25-80s，最佳35-60s；步骤(b)较佳的60-300s，更佳60-150s，最佳100-150s。

在另一优选例中，所述的核酸分子包括DNA、RNA、或DNA-RNA杂合分子。

在另一优选例中，所述扩增体系含有待扩增DNA、dNTP、引物、聚合酶和镁离子。

在另一优选例中，在步骤(a)和/或(b)中，通过添加碱性溶液或酸性溶液来调节扩增体系的pH值。

在另一优选例中，通过向扩增体系中添加碱性溶液调节扩增体系的pH值至pH10-14。

在另一优选例中，所述的碱性溶液包括：NaOH溶液、KOH、Ca(OH)₂等强碱性溶液，以及BR缓冲液(pH＝11～14)、磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液(pH＝10～12)等能够将反应体系pH值调节至碱性(pH＞10)的缓冲液。

在另一优选例中，通过向扩增体系中添加酸性溶液调节扩增体系的pH值至pH5-8。

在另一优选例中，所述的酸性溶液包括：HCl溶液、H₂SO₄溶液、HNO₃溶液，H₃PO₄溶液等强酸溶液，以及BR缓冲液(pH＝0～3)、磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液等能够将反应体系pH值调节回中性的缓冲液。

在另一优选例中，所述方法还包括：通过电化学方法调控扩增体系的pH值。