[发明专利]一种乳腺癌干细胞的分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞的分离，具体涉及一种乳腺癌干细胞的分离方法。

背景技术

全世界每年约有120万妇女患乳腺癌，50万死于乳腺癌。在西欧、北美等发达国家，乳腺癌发病率占女性恶性肿瘤首位。相关资料显示，西方妇女乳腺癌的发病人数高峰期为50～55岁，而且随着年龄的增长，发病率也不断提高。

与发达国家相比，中国虽属乳腺癌的低发区，却是乳腺癌发病率增长最快的国家之一，中国抗癌协会公布的统计数字显示，我国近年来乳癌发病率正以每年3%的速度递增，近5年增长了3倍，成为城市中死亡率增长最快的癌症之一。其中，近十年来，中国主要城市乳腺癌发病率增长了37%，死亡率增长了38.9%，农村死亡率增长了39.7%。此外，中国女性的乳腺癌发病年龄，要比西方女性小10岁左右，且大城市女性乳腺癌发病率有逐步接近欧美发达国家水平的趋势，发病年龄也呈年轻化发展。

乳腺癌具有侵袭性和难治愈的特点,治疗后仍有可能复发或转移,而其起源、复发与转移的真正原因可能是存在于乳腺癌内极少数具有干细胞的自我更新能力和多向分化潜能的细胞群，即乳腺癌干细胞，这些细胞具有化疗、放疗及缺氧抵抗性，同时具有高致瘤性、高侵袭转移性，在乳腺癌的发生﹑发展乃至转移﹑复发中起着极其重要作用。然而，放疗和化疗对存在于肿瘤中数量较少的干细胞样细胞群疗效甚微，经过治疗后残存的乳腺癌干细胞的增殖足以促使乳腺癌复发和转移。

研究表明，CD44+CD24-是致瘤性乳腺癌干细胞最基本的表型标记，此类细胞亚群在乳腺癌中起着干细胞样作用，与乳腺癌侵袭、归巢和转移密切相关。因此，开发以乳腺癌干细胞为靶点的新一代抗肿瘤生物及免疫药物成为了根治乳腺癌的发展方向之一。然而，由于乳腺癌干细胞在乳腺癌组织中的比例只有1%左右，因此如何分离获得有效的乳腺癌干细胞，并在体外进行大规模扩增培养，建立乳腺癌干细胞系，成为了乳腺癌干细胞技术发展的瓶颈。

目前，主要采用密度梯度离心法、流式细胞分选法和免疫磁珠分选法来分离乳腺癌干细胞，三者均有利弊。密度梯度离心法分离的乳腺癌干细胞纯度和细胞活性不高；流式细胞分选法所需仪器设备的费用昂贵，操作过程复杂，需要专业技术人员进行操作；免疫磁珠分选法初次分选的乳腺癌干细胞纯度较低，需进一步纯化。

免疫磁珠法分离法是基于细胞表面抗原能与连接在磁珠上的特异性单克隆抗体相结合，在外磁场作用下，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面标记抗原的细胞由于不能与相连着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，因此不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。免疫磁珠分离法有阳性分选法和阴性分选法，阳性分选法的磁珠结合的细胞是所要分离获得的细胞，而阴性分离法的磁珠结合的细胞为不需要细胞。免疫磁珠分离法初次获得的靶细胞纯度不高，因此需要对靶细胞进一步富集纯化。

由于肿瘤干细胞既能发生对称性分裂，引起肿瘤干细胞的自我更新，也能发生非对称性分裂产生干细胞与祖细胞，后者可进一步分化成后代细胞。因此如何使分选出来的乳腺癌上皮细胞富集更多的乳腺癌干细胞，并且保证干细胞只发生对称性分裂而不发生或少量发生分化，是研究人员一直致力研究的课题。

发明内容

本发明提出了一种乳腺癌干细胞的分离方法，解决了现有技术中的不足，该分离方法所获得的细胞表面因不含有抗体和磁珠的干扰；而且可保证乳腺癌细胞的分离效率及其乳腺癌干细胞富集后的纯度；不仅能高效分离数量较少的乳腺癌上皮细胞，而且缩短了分离时间，降低了分离成本，安全有效。

本发明的技术方案是这样实现的：一种乳腺癌干细胞的分离方法，采用胸腔穿刺手术收集的胸水进行乳腺癌干细胞的分离，将采集的胸水在2-4小时之内处理，具体步骤如下：

（1）制备胸水单细胞悬液：

在转速为400-600rpm下离心胸腔穿刺手术收集的胸水，以最大程度减少对细胞的损伤，并充分收集目标细胞；用含有1.5-2.5%热灭活的胎牛血清和2mmol/L的Hank平衡盐溶液洗涤细胞碎片后离心，加入红细胞裂解液Tris-NH₄Cl裂解红细胞，将红细胞裂解后，再用2mmol/L的Hank平衡盐溶液洗涤，离心，去除上清；

由于乳腺癌胸水转移大多为血性，含大量红细胞，其红细胞含量往往超过StemSepTM(StemCell Technologies)的纯化能力，因此可用红细胞裂解液（Tris-NH₄Cl）将离心洗涤后的细胞碎片中的红细胞裂解，再用Hank平衡盐溶液洗涤细胞碎片，所得到的乳腺癌组织细胞中不含红细胞，可进一步用于后续乳腺癌干细胞的分选；