[发明专利]台湾稻螟对有机磷农药靶标抗性突变检测方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及台湾稻螟(Chilo auricilia Dudgeo)对有机磷农药靶标抗性突变的分子检测方法，属于生物技术领域。

二、背景技术

台湾稻螟是我国南方稻区以及我国台湾省水稻种植区内的常发性害虫，属于钻蛀性害虫，较难防治，若防治不及时或用药不当往往造成水稻的大量减产。

一直以来，对包括台湾稻螟在内的多种水稻螟虫的防控，主要依赖化学农药，然而持续使用某种或几种作用机理相似的化学农药，导致了水稻螟虫抗药性的形成与发展。目前，水稻螟虫抗药性的形成和发展是导致水稻螟虫周期性大爆发的主要原因之一。昆虫对杀虫剂产生抗性的生理生化机制主要包括：表皮穿透速率降低、解毒酶活性的增强、药剂靶标不敏感性，其中药剂靶标不敏感性是最主要的抗性机制。

目前，防治台湾稻螟(以及其他稻螟)的主要农药之一是有机磷类农药，诸如三唑磷、毒死蜱等。三唑磷和毒死蜱这两种有机磷类农药在20世纪90年代初期及中后期逐渐开始使用，到21世纪这两种农药已经在大范围内大量被使用。有机磷类农药在台湾稻螟体内的作用靶标是乙酰胆碱酯酶(AChE)。有机磷农药的大量及长期使用导致台湾稻螟及其他水稻螟虫对这类农药产生了一定程度的抗性，而乙酰胆碱酯酶的基因序列突变是导致抗药性产生最主要的原因。本检测方法中的突变位点是台湾稻螟乙酰胆碱酯酶1的保守结构域“FGEPAG”中的A314S突变。

通常，对台湾稻螟的抗性检测是通过生物测定实现的，生物测定方法是基于生理生化的指标来获知相关抗性情况，因而这种检测方法不能检测早期抗性或低频率抗性等位基因突变。同时，生物测定方法普遍存在以下缺点：第一，周期长：生物测定结果一般需要24小时以上，台湾稻螟对三唑磷和毒死蜱的生物测定结果检查时间为48小时。此外常常需要进行前期的预试验以确定合适的药剂浓度及浓度梯度；第二，灵敏度低：生物测定很难检测早期抗性和低频率抗性等位基因突变，尤其是抗性等位基因是隐性或不完全隐性时；第三，试虫数量需求大：测定一个标准曲线至少需要400头试虫，由此必须投入大量精力到试虫的饲养工作中；第四，重现性偏差：用于生物测定的试虫需要个体龄期及体型大小尽量一致，但由于不同操作者的把握尺度有一定偏差，这就导致生物测定结果的偏差，再有对试虫死亡的判断标准有偏差也会影响生物测定的结果。为此，我们迫切需要一种快速、灵敏、便捷、标准化的抗性检测方法。

三、发明内容

1、发明目的

提供一种台湾稻螟对有机磷农药靶标抗性突变的分子检测方法，达到快速、灵敏、便捷、标准化目的。

2、技术方案

以待测样本的基因组DNA为模板，利用特异引物F：5’-AGGTGGCTTTTACTCTGGGA-3’和R：5’-AATGAATGCGGACAGTGAAC-3’进行PCR扩增。扩增产物用限制性核酸内切酶MspA1 I进行酶切消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。如果有两条电泳条带(248bp和172bp)，说明该个体是敏感纯合子(SS)；如果只有一条电泳条带(420bp)，说明该个体是抗性纯合子(RR)；如果有三条电泳条带(420bp、248bp和172bp)，说明该个体是抗性杂合子(RS)。

3、有益效果

本发明方法与传统方法相比，主要优点有：

(1)快速：生物测定技术至少需要等待48小时才能观测结果。而本发明中的RFLP-PCR技术只需要不到8个小时的时间，就可以得出理想的结果。

(2)灵敏度高：低频率抗性突变纯合子或杂合子的存在和一定的筛选压力，是高水平抗性产生的关键因子，而生物测定技术是一种较粗放的检测方法，无法检测早期抗性或低频率的抗性突变纯合子或杂合子。本发明基于RFLP-PCR的原理，可以直接判断个体的基因型。通过适当数量的个体的检测，可以很快确定某个害虫种群中抗性纯合子、杂合子和敏感纯合子的频率。

(3)便捷，试虫需求少：生物测定技术中测定一个标准曲线至少需要400头标准试虫，饲养这些试虫需要花费很大的人力物力。而本发明对一个种群的检测只需要50头左右的试虫。

(4)易于标准化，准确性高：生物测定技术要求试虫尽可能一致，因为虫体之间的差异对结果影响很大，此外操作者的不同也极易导致生物测定结果的误差。本发明基于RFLP-PCR的检测技术，PCR技术具有标准化的操作流程，使得本发明方法的结果有很好的重现性以及极高的准确性。

四、具体实施方式

1、样本基因组DNA的提取