[发明专利]一种基于T7表达系统的重组质粒

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基于T7表达系统的重组质粒及其转化体，适用于在DE3溶源化菌株以外的宿主中表达外源基因。

背景技术

T7表达系统由T7噬菌体基因组上的启动子，以及能特异性识别该启动子的T7RNA聚合酶构成。该系统可以高特异性，高效率地转录T7启动子后面的DNA序列，同时被一种T7噬菌体基因组上的终止子T7Φ特异性终止，因而被广泛地应用于原核生物中外源基因的表达。

其中T7RNA聚合酶是在T7噬菌体（Enterobacteria phage T7）中被发现，它是一种能侵染大肠杆菌（Escherichia coli,简称E.coli）的烈性噬菌体，其遗传物质为双链的线性DNA，长度约为39.94 kbp。T7噬菌体基因组上的基因1（Gene 1）长2652bp，由大肠杆菌启动子启动转录，并能被翻译得到一个含有883个氨基酸残基、分子量约为98kDa的蛋白质，即T7 RNA聚合酶。该RNA聚合酶不能识别大肠杆菌中原有的启动子，只能识别T7噬菌体基因组上特异性的启动子，即T7启动子，并依据DNA模板合成RNA。

目前，T7表达系统广泛用于大肠杆菌外源基因的表达，其中Novagen公司推出的pET系列质粒载体和DE3溶源化大肠杆菌菌株应用最为广泛。

pET质粒载体上带有一个T7启动子，下游有lacO基因，并在多克隆位点的下游插入了终止子T7Φ。 pET质粒上带有lacI基因，能产生阻遏蛋白，达到控制基因转录的目的。

如果将目的基因插入到pET质粒上T7启动子的下游，并转化一般的细菌，是不能使目的基因得到表达的，因为细菌中的RNA聚合酶不能识别T7启动子。因此，pET质粒需要配合BL21(DE3)等溶源化菌株使用。在BL21(DE3)溶源化大肠杆菌菌株的基因组上，in基因被打断，中间插入了编码阻遏蛋白的lacI基因和T7 RNA聚合酶的Gene 1。Gene 1被连接在一个lacUV5启动子的下游，一般情况下受到lacO基因的调控而不能表达。如果细胞受乳糖或IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）诱导，LacI蛋白对lacO基因的阻遏解除，则Gene 1将表达产生T7 RNA聚合酶，进而转录pET质粒上T7启动子下游的序列。

在T7表达系统被发现后，其高效性和特异性引起了人们的兴趣。而现有的T7表达系统依赖DE3溶源菌等特殊菌株或病毒载体，使用起来很不方便。

于是有研究者开始着手克隆、表达编码T7 RNA聚合酶的基因，但这项工作遇到了很大的障碍。1980年代的研究者缺乏像今天一样成熟的PCR技术，只能选择从T7噬菌体的基因组上用限制性内切酶切下Gene 1。在T7噬菌体的基因组上，Gene 1后面紧接着两个T7启动子，而在这些启动子前没有可用的限制性位点将它们与Gene 1分开。这种带有Gene 1和T7启动子的限制性片段无法被成功地连接到质粒载体上并转化宿主。当时的研究者分析，造成这种情况的原因，是Gene 1编码的T7 RNA聚合酶与T7启动子之间产生正反馈作用，造成质粒DNA过量转录，进而耗尽细胞内的资源，使宿主细胞无法继续生长。注意到这种限制性片段上，Gene 1的方向与T7启动子相同。当Gene 1被转录并翻译得到T7 RNA聚合酶后，聚合酶识别T7启动子并开始转录。由于该系统的转录效率很高，转录可能产生绕整个质粒、包含Gene 1的mRNA，这些mRNA翻译将得到更多的T7 RNA聚合酶。这样，便形成了T7 RNA聚合酶与mRNA产生的正反馈循环，宿主细胞则因为资源在这个过程中被耗尽而无法生长。为了得到Gene 1的完整序列而不引入后面的T7启动子，研究者在T7噬菌体的基因组上进行了一系列的突变，设法删去了含有T7启动子部分，并引入了新的限制性位点。这种方法最终使人们得到了包含Gene 1完整序列的质粒，并成功表达出了有活性的重组T7 RNA聚合酶。

此后，研究者尝试向带有Gene 1的质粒上插入一段由T7启动子控制的基因。尽管质粒上Gene 1受到乳糖操纵子lacO基因的控制，这一尝试仍以失败告终。可能的原因是，即使在非诱导条件下，lacO基因并不能完全被LacI蛋白阻遏，因而下游的Gene 1有少量的表达。这种本底表达产生的少量T7 RNA聚合酶依然导致了T7启动子下游序列的过量转录。

因此可以看出，T7表达系统有一定的致死性，如果想简单的将T7表达系统整合到一个质粒上，是比较困难的。但是pET质粒载体和DE3溶源化菌株通过以下几方面的作用避免了上述问题：