[发明专利]一种利用棕绳固定化细胞连续制备β-环糊精的方法

说明书

技术领域

一种利用棕绳固定化细胞连续制备β-环糊精的方法，属于β-环糊精生产技术领域。

背景技术

环糊精（cyclodextrin，CD）称作环聚葡萄糖又名环链淀粉，Viller在1891年通过软化芽孢杆菌作用于淀粉，经酶降解所得产物而发现了环糊精。由于环糊精具有内疏水外亲水的筒状结构，使其具有很多特别的性能，能与范围极其广泛的各类客体，比如有机分子、无机离子、配合物甚至惰性气体，通过分子间相互作用形成主客体包合物，从而对客体具有屏蔽、控制释放、活性保护等功能，因而广泛应用到医药和食品领域。β-环糊精制备工艺简单，成本较低，是目前国内唯一工业化生产的环糊精。酶法制备β-环糊精，安全污染小，是国外内制备β-环糊精的主要方法。但是，酶法制备β-环糊精过程中，由于影响菌种生长因素较多，造成菌种生长速度很不稳定，使得整个生产过程周期难以估算控制，造成严重的原料浪费和能源浪费，增加了生产成本。固定化细胞的方法，可以增加菌种的生长稳定性，缩短种子液生长周期，并且能够反复多次使用菌种，从而使得环糊精的生产具有持续性，降低成本。国外已有固定化细胞的相关报道，报道结论证实了固定化细胞对于维持环糊精糖基转移酶（CGTase）的连续活性具有重要作用。国内尚无相关报道。本发明首次采用棕绳这一天然易得材料作为固定化基质，用于固定化CGTase产生菌，利用细菌对于棕绳的天然附着力实现细胞固定化，固定化过程简单，连续化生产效果显著，为工业连续化生产CGTase以及β-环糊精提供依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用棕绳固定化细胞连续制备β-环糊精的方法，增加环糊精生产周期的可控性，降低生产成本。

本发明的技术方案：一种利用棕绳固定化细胞连续制备β-环糊精的方法，以棕绳固定化细胞，实现环糊精糖基转移酶CGTase连续培养，从而实现β-环糊精的连续化制备，步骤为：

（1）制备固定化基质棕帘：棕绳编织成帘，棕帘需要先用0.3%-0.5%NaOH溶液浸泡24h，再经煮沸4-6h，121℃ 20min灭菌，待用；

（2）种子培养：采用菌株ATCC 21783为CGTase产生菌，投放入培养基中，培养基为：可溶性淀粉1%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，磷酸氢二钾0.1%，七水硫酸镁0.02%，碳酸钠1%，其余为净水，调整pH8.5；200rpm摇床培养3天，待光密度达到0.8，作为种子液；

（3）棕绳固定化培养：培养基中接种1%-3%的光密度为0.8的种子液，投放棕帘，棕帘比表面积与培养基体积的比为1:3-2:3 (cm²:mL)，pH8.5，29℃，200rpm摇床培养；培养2-3天后，至光密度达到1.0；

（4）CGTase连续培养：无菌条件下将棕帘取出，首次培养发酵液离心除菌后用以制备β-环糊精；取出的棕帘用灭过菌的0.9%的生理盐水冲洗，投入新鲜配制、121℃ 20min灭菌的培养基中，继续在与步骤（3）相同的条件下培养24-48h，得CGTase酶液；

（5）按步骤（4）中所述方法取出棕帘，投放到下个循环中继续使用；此次及以后所得发酵液无需离心，可直接做CGTase粗酶液催化淀粉制备β-环糊精；

经10-15个循环后，酶活仍可保持为初酶活的80%-90%；

（6）β-环糊精的连续化制备：将所得的酶按照无溶剂法制备β-环糊精的方法，生产制备β-环糊精。

本发明的有益效果：一是实现菌种的反复利用，增加了菌种的生长稳定性，缩短种子液长成时间，因而使得整个生产过程具有可控性及连续性。二是固定菌的可操作性强，操作简单，基本可免去分离纯化酶液的过程，简化了生产过程。三是酶活力相对稳定，在连续生产过程中，并没有因为使用周期的延长而造成酶活力的大幅降低。这就保证了连续化生产过程中环糊精产量的稳定性。四是整个生产周期稳定，利于及时合理的安排各生产阶段工作，减少了对原材料及能源的损耗，降低了成本。

附图说明

图1 连续发酵酶液催化淀粉制备β-环糊精的框图。

具体实施方式

实施例1