[发明专利]一种基于硝酸纤维素膜的便捷癌细胞捕获芯片

说明书

技术领域

本发明属于生物分析与检测技术领域，具体为一种循环肿瘤细胞（CTC）捕获芯片。

背景技术

循环肿瘤细胞（CTC）是指那些从肿瘤组织上脱落下来并进入血液全身循环的癌细胞。它由普通癌细胞转化而来，并且随时可以通过逆分化再次长出肿瘤组织，因此它与癌症的扩散和转移密切相关，是反映癌症病情发展的风向标，对其进行详尽研究对于癌症的早期诊断与治疗具有决定性的意义。人体外周血液中CTC的含量很低，一般不会超过100 个/mL， 而其中的红细胞白细胞等背景干扰细胞则高达10⁹个，这对现有的分离分析方法来说是一个巨大的挑战。总的来说，目前的研究亟需解决两个方面的问题：一是怎样把数量如此少的CTC从背景如此复杂的人血中分离出来？二是如何对分离的少量CTC进行高灵敏的检测计数和后续的生化分析。

近十年来，关于循环肿瘤细胞的分离捕集研究受到了国内外的广泛关注，一系列研究成果也相继被报道。美国强生公司推出了基于免疫磁珠分离的循环肿瘤细胞检测与分析系统（CellSearchTM），率先得到了美国食品药品管理局（FDA）的认证并已广泛用于临床诊断，不过费用昂贵，而且假阳性率比较高。近来微流控芯片成为了CTC分离研究的热点，Nagrath等报道了基于EpCAM抗体组装的微流体芯片阵列，对相应的循环肿瘤细胞具有很高的捕获效率；Hosokawa等基于癌细胞与正常细胞的形态差异，制成了体积排阻分离装置，扩展了CTC研究的思路；国内的王树涛也基于硅板表面的纳米纤毛与癌细胞表面的结构相互作用，开发了一种硅板芯片，其对癌症病人血液样本的检测效果要好于当前的CellSearch^TM系统。目前报导的这些关于CTC芯片的最新研究成果，其对CTC的捕集效率较高，假阳性也控制得不错，但是芯片的制备过程大多太复杂，而且重复性较差，很难大规模生产，严重妨碍了其在临床应用上的前景；另外由于芯片孔道的尺寸限制，对病人血液的分析耗时很长，而且捕获的癌细胞也不方便进行后续的再培养等生化分析。

基于以上认识，目前CTC的研究真正需要的是一种设计新颖，制备便捷，分析快速高效的CTC捕获芯片。最近各种膜基底平台开始广受关注，因此我们设计研究了一种以硝酸纤维素膜（NCM）为基底的CTC高效捕集芯片。硝酸纤维素膜常用于免疫印迹（western blotting）等生化分析中，利用其对蛋白质优良的吸附效能，可以方便地吸附上抗体进行CTC特异性捕获，简便高效；另外还可利用其良好的生物亲和性和在蛋白质组学分析中的特殊作用，对捕集到的癌细胞进行生物学再培养和单细胞蛋白质组的研究。由于其在生物分析上的巨大优势和潜能，我们采用硝酸纤维素膜为基底吸附固定抗体来制备CTC芯片。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备简便，对癌细胞捕集效率高，成本低易于大规模推广应用的CTC捕获芯片。

本发明提供的CTC捕获芯片，以硝酸纤维素膜为主体，其透明软化后固定在PMMA有机玻璃板上，然后直接吸附固定上抗体而组成，可以用来进行癌细胞的特异性捕集。

本发明中，硝酸纤维素膜的孔径为0.2--0.45 μm。 

本发明以硝酸纤维素膜为基底，其具有良好的生物亲和性，广泛应用于western blotting等生化分析，适宜作为生物分析检测的平台；同时硝酸纤维素膜具有对蛋白质天然的吸附性能，因而可以直接物理吸附固定抗体，相比于化学结合的方法更为便捷，效率也更高；硝酸纤维素膜在乙醇中浸泡处理后会变软变透明，可以方便地固定在PMMA基板上，同时也便于对捕获到的癌细胞进行光学检测。

本发明的CTC芯片的制备步骤如下：

（1）将商品化的硝酸纤维素膜切成1-3 cm×1-3 cm的小块，然后放入纯乙醇中浸泡3-15 s，让其软化变透明，并平铺在预先剪裁好的PMMA平板上自然风干，装配制作出芯片基底；

（2）在吸附抗体以前，芯片基底需要在含10%-30%乙腈的1-5 mM PBS缓冲液中浸泡0.5-1 h活化；然后把20-60 μL抗体（浓度为0.5 μg/μL）溶解在200 μL含10%-30%质量乙腈的1-5 mM PBS缓冲液中，均匀滴加在CTC芯片基底上，在37 ℃下反应0.5-1 h，利用静电作用和疏水作用让抗体吸附固定在CTC芯片上；然后用PBS缓冲液洗去多余的抗体，再加上50 μL的BSA溶液（质量浓度为 0.1%-0.5%）封端半小时，以降低其对癌细胞的非特异性吸附。制备好的CTC芯片保存在4 ℃冰箱备用。

本发明CTC芯片用于捕获癌细胞的过程如下：