[发明专利]一种辅助鉴定蕃茄丛矮病毒的试剂及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种辅助鉴定蕃茄丛矮病毒的试剂及其应用。

背景技术

番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus，ToBSV），属番茄丛矮病毒科、番茄丛矮病毒属病毒。该病是我国对外重要的检疫对象，也是进境葡萄种苗等必需施检的项目。

病毒粒体为球状，正20面多角休，直径30nm，分散在细胞质和液泡内，有时呈晶体状排列。致死温度80～90℃10分钟。体外存活期为几周。该病毒能侵染番茄、曼陀罗、葡萄、豇豆等20多个科，120多种植物。苗期染病5天后初显环状坏死斑，叶片褪绿且迅速落叶，该病在茎组织发展很快，苗期施用氮肥过多，造成茎变软，在靠近地面处出现坏死斑，引起猝倒。系统症状为幼叶卷曲或顶部坏死，由此引致侧芽增生或出现丛生。病株下部叶片褪绿和变紫。果实除产生褪绿斑以外，还在成熟果实上产生环状或平行斑，使番茄矮缩或产生斑驳。

ToBSV经汁液传毒。该病毒进入寄主，必须在土壤积水的条件下。侵染方法尚未明确，但似乎可通过损伤的根细胞侵入。ToBSV不能被消化，即使通过人、畜的消化道也不能改变其传染性，因此，有推断认为人和动物是该毒原传播途径之一。此外，ToBSV在河水中发现，污水和淤泥作为肥料时，有可能传播该病毒。

目前，番茄丛矮病毒检测技术的研究报道较少，主要以寄主症状、免疫电镜技术和酶联免疫吸附测定（ELISA）为主。

电镜技术设备昂贵，检测灵敏度低；ELISA技术操作步骤繁琐、检测周期长、灵敏度低、易出现假阳性。未见采用半巢式-RT-Realtime PCR检测ToBSV的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种辅助鉴定蕃茄丛矮病毒的试剂及其应用。

本发明提供的辅助鉴定蕃茄丛矮病毒的试剂，包括特异引物；所述特异引物由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成。

所述试剂可由所述特异引物和特异探针组成；所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列4所示。所述特异探针可为TaqMan探针。

所述试剂可用于制备辅助鉴定蕃茄丛矮病毒的试剂盒。

本发明还保护一种辅助鉴定蕃茄丛矮病毒的试剂盒，包括所述试剂。

所述试剂可用于辅助鉴定蕃茄丛矮病毒。

本发明还保护一种辅助鉴定蕃茄丛矮病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对甲进行PCR，得到PCR产物甲；以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对乙进行PCR，得到PCR产物乙；如果PCR产物甲为78bp且PCR产物乙为99bp，待测病毒为候选的蕃茄丛矮病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对。

本发明还保护另一种辅助鉴定蕃茄丛矮病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对甲和特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增曲线甲；以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对乙和所述特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增曲线乙；根据扩增曲线甲和扩增曲线乙判断待测病毒是否为候选的蕃茄丛矮病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对；所述特异探针为TaqMan探针，核苷酸序列如序列表的序列4所示。如果所述扩增曲线甲和所述扩增曲线乙均为阳性，待测病毒为候选的蕃茄丛矮病毒。

所述待测病毒具体可为蕃茄丛矮病毒、藜草花叶病毒、番茄黑环病毒、草莓潜环斑病毒或桃丛簇花叶病毒。

本发明还保护一种检测待测样本中是否含有蕃茄丛矮病毒的方法，包括如下步骤：

（1）提取待测样本的总RNA，反转录为cDNA；

（2）以所述cDNA为模板，用特异引物对甲和特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增曲线甲；以所述cDNA为模板，用特异引物对乙和所述特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增曲线乙；根据扩增曲线甲和扩增曲线乙判断待测样本中是否含有蕃茄丛矮病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对；所述特异探针为TaqMan探针，核苷酸序列如序列表的序列4所示。如果所述扩增曲线甲和所述扩增曲线乙均为阳性，待测样本含有蕃茄丛矮病毒。