[发明专利]一种优秀冰雪运动员EB病毒转化细胞凋亡鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用流式细胞术鉴定优秀冰雪运动员爱泼斯坦-巴尔病毒(epstein-barr virus，EB)转化细胞凋亡鉴定方法。

背景技术

细胞永生化技术发展到今天已有了长足的进步，EB病毒、猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus40，SV40)都是永生化细胞常用的转化病毒。EB病毒转化优秀冰雪运动员外周血B淋巴细胞建立的永生细胞株让原本有一定寿命的人体细胞能够不间断地繁殖下去，使一些特殊细胞的增殖能力加强，细胞凋亡率减小。优秀冰雪运动员EB病毒转化细胞可以永久的保存人类与杰出运动能力相关的基因资源，同时解决以往实验研究的接力式进行与标本的暂时性采集中存在的矛盾，以便有效的对同一研究对象进行持久的连续性研究。EB病毒转化细胞凋亡表现出与普通细胞凋亡相同的形态特征和生活化特征，但因其细胞凋亡率很小，许多检测方法难以检测或检测结果准确率很低。细胞凋亡鉴定主要是利用细胞形态学特点和生化特征来进行的。通常是通过光学显微镜、荧光显微镜和电子显微镜对组织或细胞进行各种染色来观察凋亡现象，其次是采用原位末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl trasnferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick-end labelling assay，TUNEL)和DNA琼脂糖凝胶电泳法来分析凋亡情况，但这些方法都存在检测费用昂贵、主观性太强且不可定量检测等弊端。近年来，随着流式细胞分析术的不断发展，应用该项技术检测细胞凋亡得到充分的应用。异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)与碘化丙啶(Propidium iodide，PI)复染法，即Annexin V-FITC/PI双标记法能够定量分析细胞凋亡，磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)能与连接素V(Annexin V)发生特异性结合。PI为核酸荧光染料，不能透过正常细胞膜，只能进入已经破损的细胞膜。细胞发生凋亡时，其细胞膜的磷脂对称性改变而使PS暴露于细胞膜外(即PS外翻)，且凋亡细胞仍然保持其细胞膜的完整性，因而能与Annexin V(荧光素标记的Annexin V，如FITC-Annexin V)结合，而不能结合核酸荧光染料PI，仍保留细胞膜结构的坏死细胞虽PS不发生翻转，但由于其细胞膜的通透性发生了改变，Annexin V仍能进入细胞内与细胞膜内表面的PS结合，但同时也能被PI着色；晚期凋亡的细胞因PS外翻和膜通透性发生了改变，被Annexin V和PI标记，也呈Annexin V⁺/PI⁺；正常细胞因胞膜完整且不发生PS翻转现象，所以不能被Annexin V和PI标记，表现为双阴性。Annexin V-FITC/PI双标结合流式细胞术检测法克服了单染检测结果不准确的缺点，并且可定量分析优秀冰雪运动员EB病毒转化细胞凋亡情况，可定量区分早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。

发明内容

本发明的目的是提供一种优秀冰雪运动员EB病毒转化细胞凋亡定量分析方法；提供一种优秀冰雪运动员EB病毒转化细胞凋亡鉴定方法步骤。

附图说明

图1流式细胞术检测优秀冰雪运动员EB病毒转化细胞凋亡率

C1：坏死和机械性损伤细胞

C2：早期凋亡细胞

C3：活细胞

C4：晚期凋亡细胞

具体实施方式

(1)制备单细胞悬液，收集EB病毒转化细胞于流式管中，1200rpm，离心8min。

(2)用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)洗涤细胞二次(1200rpm离心8min)收集(1-5)×10⁵细胞。

(3)每个样品加入100μl的连接缓冲液(Binding Buffer)悬浮细胞。

(4)同时加入5μl FITC和5μl PI双染，混匀。

(5)用已知可使EB病毒转化细胞凋亡的药物(如喜树碱)诱导细胞凋亡，作为阳性对照。检测前分别用5μl FITC和PI染色。

(6)室温，避光，反应5-10min。

(7)首先在488nm共聚焦下观察细胞的凋亡情况。

(8)补充400μl Binding Buffe，400目筛网过筛，1h内进行流式细胞术定量检测。

(9)结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC-/PI-)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(FITC+/PI+)；而右下象限为凋亡细胞，显现(FITC+/PI-)。