[发明专利]用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物及试剂盒

说明书

技术领域

   本发明涉及动物医学领域，具体涉及用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物及试剂盒。 

背景技术

  鸭瘟病毒（Duck Enteritis Virus）是引起鸭瘟（Duck Plague）的病原，属于一种疱疹病毒，能感染48种以上的雁形目的家禽和野生禽类。鸭瘟，又称鸭病毒性肠炎，是一种急性传染病，其发病率和病死率可达100%，鸭瘟的病变包括血管损伤，胃肠道粘膜的进行性变化，淋巴器官病变和实质性器官的退行性变化。接种鸭瘟弱毒疫苗是控制该病的有效方法。鸭瘟病毒能在三叉神经节形成持续性感染。鸭瘟病毒的诊断方法有病毒中和试验（NT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和 PCR试验等。NT、ELISA和普通的PCR方法只能诊断是否是鸭瘟病毒，但无法鉴别鸭瘟病毒是强毒株还是弱毒株。公开的发明专利“一种鉴别鸭瘟病毒强毒与疫苗毒的PCR检测方法”（申请号：201210116719.2），通过UL2基因差异区分鸭瘟病毒强、弱毒株，但此方法仅能鉴别鸭瘟病毒是强毒还是弱毒，而无法鉴别鸭瘟病毒是欧洲源的强毒，还是中国源的强毒，也无法鉴别是中国的疫苗毒（弱毒）的VAC株或是Clone-03株。 

发明内容

本发明的目的是提供用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物，特异性强，能够鉴别样品是否感染鸭瘟病毒；如果样品感染鸭瘟病毒，究竟是欧洲强毒株、中国强毒株、中国疫苗株（弱毒株）VAC株还是中国疫苗株（弱毒株）Clone-03株。 

本发明的另一目的是提供用于鉴别鸭瘟病毒的试剂盒，能够鉴别样品是否感染鸭瘟病毒；如果样品感染鸭瘟病毒，究竟是欧洲强毒株、中国强毒株、中国疫苗株（弱毒株）VAC株还是中国疫苗株（弱毒株）Clone-03株。 

本发明的再一目的是提供上述引物组合物的应用。 

用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物，由上游引物和下游引物组成，所述上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。 

所述上游和下游引物的浓度为0.01mol/ml。 

用于鉴别鸭瘟病毒的试剂盒，包括所述引物组合物、PCR缓冲液、dNTPs和ExTaq酶。 

所述dNTPs为dATP、dTTP、dGTP和dCTP的等浓度混合物，所述dATP、dTTP、dGTP或dCTP的浓度均为2.5Mm。 

所述引物组合物在制备用于鉴别鸭瘟病毒的试剂盒中的应用。 

一种应用所述引物组合物鉴别鸭瘟病毒的方法： 

（1）提取待检样品的DNA； 

（2）以步骤（1）中所述DNA为模板，用权利要求1或2所述引物组合物为引物，进行PCR扩增反应，获得PCR产物；

（3）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，判断所述PCR产物的长度；当PCR产物长度为4430-4460bp时，待检样品感染中国来源的鸭瘟病毒强毒株；当PCR产物长度为3260-3290bp时，待检样品感染欧洲来源的鸭瘟病毒强毒株；当PCR产物长度为920-950bp，待检样品感染中国来源的鸭瘟病毒VAC株；当PCR产物长度为2510-2540bp，待检样品感染中国来源的鸭瘟病毒Clone-03。

所述中国来源的鸭瘟病毒强毒株为鸭瘟病毒LH2011株和CHv株中的一种或两种；所述欧洲来源的鸭瘟病毒强毒株为鸭瘟病毒Jansen、Holland、D11-JW-016和v2085株中的一种或两种以上。 

步骤（2）中PCR扩增反应的条件为： 94℃预变性3min；94℃变性30sec，52℃退火40sec，72℃延伸3min40sec，循环40次；最后72℃延伸10min。 

本发明提供的引物组合物或试剂盒，能够鉴别样品是否感染了鸭瘟病毒；如果感染鸭瘟病毒，究竟是欧洲强毒株、中国强毒株、中国疫苗株（弱毒株）VAC株还是中国疫苗株（弱毒株）Clone-03株。 

采用本发明的引物组合物或试剂盒鉴别鸭瘟病毒，快速、简便，特异性和敏感性强，而且成本低廉。适用于临床诊断，科学研究，疫苗生产和出入境检测等，应用前景广阔。 

  

附图说明：

图1为不同毒株鸭瘟病毒的LORF11等位基因序列的比较。图中Jansen、Holland、D11-JW-016和v2085株是欧洲鸭瘟强毒株，LH2011和CHv株是中国鸭瘟强毒株，VAC株和Clone-03株是中国疫苗株。该图中，具有相同填充的条带表示相同序列或者仅有个别碱基发生同义或非同义替代的序列；线条引出标注了各段条带的序列长度。