[发明专利]用于21三体综合征检测的扩增组合物及快速检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，特别是涉及21三体综合征检测PCR扩增组合物，共涉及10对特异性引物，及其快速检测试剂盒。

背景技术

唐氏综合征（Down’s syndrome），也称为21三体综合征（Trisomy21syndrome）是由于21号染色体数目增多一条引起的疾病，是人类最常见的染色体疾病，1866年英国医生Langdon Down首次对此病例做过临床描述，因此称为唐氏综合征。在活产婴儿中其发病率约为1/600-1/800，我国21三体的总患病率为0.47‰，其中城市为0.26‰，农村为0.56‰（张致详等，中国21三体综合征流行病学研究，《中国临床心理学杂志》，1996年03期）。21三体患儿往往生长迟缓、体力和智力障碍、生活不能自理等症状，生活状态差，并且给家庭造成很大负担。由于至今还没有有效预防和治疗方法，因此，在产前及时诊断21号染色体异常并终止妊娠对降低出生缺陷、提高人口素质有重要意义。

目前，21三体临床确诊的方法是染色体核型分析。首先要进行羊膜穿刺取羊水，然后培养羊水中胎儿细胞，再进行核型分析。整个周期需要2-3周，操作复杂，需要有经验的检测人员操作。另外近几年应用的技术为荧光原位杂交（FISH），这一方法较核型分析速度稍快，不需细胞培养，利用已知核酸序列作为探针，以荧光素直接标记或以非放射性物质标记后与靶DNA进行杂交。再通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物，最后在荧光显微镜下观察杂交信号从而对标本中待测核酸进行定性、定位和定量分析。这两种方法都具有成本较高，周期长，对操作人员要求较高的特点，同时结果为图片，需要人工判读或干预，难以实现自动化和高通量分析。

QF-PCR技术是，通过荧光引物对样本DNA的不同区域进行PCR扩增（因此荧光信号变量与扩增产物变量成正比），随后采用高分辨率胶电泳（如用于测序的毛细管电泳）对扩增片断进行分离，通过荧光检测系统确定扩增片断的长度并实现对多态位点的分型，通过扫描软件对预期大小的扩增产物对应的峰面积定量，实现对原始模板量的定量。定量荧光PCR体系（Quantitative Fluorescent PCR，QF-PCR）中同时扩增多个21号染色体上的短串联重复序列（Short Tandem Repeats，STR）基因座，利用STR基因座的多态性来判断21号染色体数目。唐氏综合征是由于21号染色体数目增多一条引起的疾病，因此对21号染色体上的STR位点经过QF-PCR扩增、检测会得到1:1:1的三个峰、2:1的两个峰或一个峰，其中前两种情况是三体综合征样本相对于正常样本所特有的。STR位点多态性越高则出现单一峰的几率越小，出现前两种情况比例越大。对多个特定染色体上的STR位点进行检测，综合考量各个位点峰数量和峰面积即可判定检测样本是否为三体综合征。

1993年Mansfield首次报道应用STR（Short Tandem Repeats，短串联重复序列）进行QF-PCR，成功检测21三体综合征（Mansfield，Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using quantitative PCR and small tandem repeat polymorphisms.Hum Mol Genet.1993;2:43–50.）。此后越来越多的研究者采用STR基因座联合检测的方法来诊断。如：专利200810152923.3，一种快速诊断唐氏综合征的方法，通过一个QF-PCR体系检测3个21号染色体的STR位点和两个对照位点；专利200710050287.9，唐氏综合征诊断试剂盒，共使用两个QF-PCR体系，每个体系包含6个21号染色体的STR位点；专利200810027138.5，定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的方法及试剂盒，通过3个QF-PCR体系检测12个位点，包括3个21号染色体的STR位点；专利201010019380.5，一种快速诊断染色体数目异常的多重QF-PCR STR检测体系，共使用三个QF-PCR体系检测25个位点，包括7个21号染色体的STR位点。上述专利往往采用的STR位点不合理或数目较少，且每个QF-PCR扩增体系中包含的位点数量少，导致检测效率和准确性不够高。

发明内容

本发明的目的是提供21三体综合征检测PCR扩增组合物，在高度复合的扩增体系中可以扩增多至10个与21三体综合征检测相关的STR位点，且通过定量荧光PCR（QF-PCR）技术扩增21三体综合征检测相关的STR位点，对21号染色体数目异常进行检测。