[发明专利]一种支持CHO高密度悬浮培养的无血清无蛋白培养基

说明书

本发明提供了一种支持CHO高密度悬浮培养的无血清无蛋白培养基。公开了培养基组分包括氨基酸、微量元素及无机盐、维生素、碳水化合物和其他有机分子，其中含有类固醇激素，而不含有转铁蛋白和胰岛素。本发明所提供的培养基化学成分明确，无动物来源，污染风险小，能适用于多种不同CHO细胞株生长，细胞培养效果好，有利于下游分离和纯化。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域。更具体地，本发明涉及用于CHO细胞培养的培养基。

背景技术

细胞培养技术是通过模拟细胞体内生长环境实现细胞体外培养。培养基为细胞体外培养提供营养并促进细胞生长和增殖。细胞培养基的发展经历了鸡胚汁、天然培养基、合成培养基，以及目前常用的低血清培养基、无血清培养基、无蛋白培养基和化学成分清晰的培养基。

通常，动物细胞的生长均有赖于血清的存在．在普通培养基中，如不加血清，绝大部分细胞将不能增殖。但使用血清的主要弊端是存在潜在的污染源，价格昂贵，批间差异大，对生产和科研带来诸多不便。科学家发现在基础培养基中加入替代血清作用的补充因子，如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素和表皮生长因子等成分，不少细胞即能在无血清供应的情况下生长。无血清培养基规避了血清带来的风险。便于产品的分离纯化。然而，一般一种无血清培养基只适用于一类细胞的培养，而且容易受到理化因素的影响。另外无血清培养基通常含有替代血清的蛋白和脂类，如转铁蛋白、脂类添加剂和胰岛素等，仍然存在一定的污染风险和分离纯化的障碍，成本也比较高。

中国仓鼠卵巢细胞——CHO细胞(Chinese hamster ovary cell)目前被广泛用于生产各种基因工程蛋白产品。适合用于CHO细胞培养的培养基，根据它的来源及成分的明确程度来划分，其发展大致可分为三个阶段：即天然培养基阶段(直接采用某些组织凝块、生物性液体和组织提取液等作为细胞的培养基)，合成培养基阶段(如MEM,DMEM,RPMI1640,F12等)和无血清培养基阶段。合成培养基通常需在其中添加一些诸如血清(常用的如小牛血清、胎牛血清等，一般在5—15%)等天然的体液性补充物才能较长时间地维持细胞生长。血清的主要作用在于向细胞提供激素(生化因子)、转移蛋白和其它营养物质等。但即使采用低血清培养，还是不能忽视血清带来的问题（如在培养过程中贴壁，不适用于大规模培养）。无血清培养基的优势很大程度上体现在避免了血清的缺点，此外它还具有血清培养难以比拟的优点，如保存和应用方便；使用该种培养基制备的产品易于纯化，提高回收率；成分明确，有利于研究细胞的生理调节机制等。但是，无血清培养基通常含有替代血清的蛋白和脂类，如转铁蛋白、脂类添加剂和胰岛素等，仍然存在一定的污染风险和分离纯化的障碍，成本也比较高。而且，一般一种无血清培养基只适用于一类细胞的培养，容易受到理化因素的影响。

发明内容

本发明是一种无血清无蛋白培养基，能适用于多种不同CHO细胞株生长的全能型培养基，它化学成分明确，无动物来源，其使用不仅将污染的风险降到最小，更有利于下游的分离和纯化。

本发明是在商业化出售的培养基DMEM/F12（可从Sigma,GIBCO等公司购买）基础上进行开发，能够支持细胞生长和稳定传代的无血清无蛋白培养基，可适用于工业规模生产。

无血清无蛋白培养基的组分一般包括葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、微量元素、类固醇激素和相关蛋白替代物，如何对这些成分进行合理设计，是开发和优化无血清无蛋白培养基的关键。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

（1)选择添加可替代生长因子、转铁蛋白和胰岛素的组分如：孕酮、氢化可的松，柠檬酸铁，硫酸锌等物质；

（2)利用统计学实验设计确定各个组分的最佳剂量；

基于以上考虑，本发明的培养基主要由以下几方面的组分构成：