[发明专利]人丙型肝炎病毒核心抗原及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于医药和基因工程技术领域，具体涉及人丙型肝炎病毒核心抗原及其制备方法和应用。

背景技术

丙型肝炎是由人丙型肝炎病毒（HCV,Hepatitis C Virus）感染引起的传染病，在全球广泛流行，尤其我国是HCV流行较严重的国家之一，人群感染率约为3.2％，有4000万以上的感染者。血源性传播是一种非常重要的传播途径，由于没有有效的预防性疫苗及有效的治疗手段，因此早期诊断及血液筛查对控制HCV的传播具有十分重要的作用。

目前临床上HCV的诊断与筛查以检测HCV抗体为主，由于HCV抗体检测一般存在7-10周的窗口期，建立早期、简便、敏感、特异的HCV核心抗原诊断试剂，缩短检测的窗口期是降低HCV感染的有效途径。虽然RT-PCR可定性和定量的检出HCV RNA并有效的缩短窗口期，但因RT-PCR操作复杂，容易污染且价格昂贵，使之不能广泛应用。研发基于丙型肝炎核心抗原的单克隆抗体，对于早期检测丙型肝炎病毒感染，通过双抗体夹心ELISA筛选能高灵敏度检测丙型肝炎核心抗原，建立丙型肝炎核心抗原检测系统并结合检测血清丙型肝炎抗体，为抗原抗体联检应用打基础。

虽然丙型肝炎核心抗原的高度保守性并兼有很强的免疫原性，但是丙型肝炎核心抗原蛋白需要宿主信号肽酶剪切其C端内信号肽序列从而加工形成成熟的核心抗原蛋白(p21)，因而造成通过基因工程尤其是原核表达出构像天然的丙型肝炎核心抗原蛋白变得异常困难。另外核心抗原蛋白极易与核酸和脂蛋结合，且其C端有很强的疏水性，也都为核心抗原蛋白的体外表达和纯化增加了难度。近年一些研究人员利用酵母和哺乳动物细胞成功表达了全长的核心抗原白(191aa，p23)，并发现p23可以被细胞的信号肽酶剪切形成成熟的p21蛋白，并可在体外自组装形成直径约35nm的核衣壳样颗粒（nucleocapside1ike particles，NLPs)。有研究者发现利用E．coli表达丙型肝炎核心抗原N端前120个氨基酸，在一定条件下也可形成病毒样颗粒（VLPs，Virus Like Particles）。并且用该VLPs免疫小鼠、兔和山羊后会产生强且持久的体液和细胞免疫应答。由于通过真核途径大量表达并纯化HCV core重组抗原在方法上并不成熟，因此很多研究者选择用大肠杆菌系统表达核心抗原蛋白，并避开核心抗原蛋白C端信号肽部分的氨基酸。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明通过基因重组技术，分段克隆HCV核心抗原基因，表达并分离纯化HCV核心抗原的GST融合蛋白抗原，该抗原用于研制HCV诊断试剂盒，尤其是在免疫阶段，用于免疫产生具有更佳亲和力与识别特性的抗核心抗原抗体，用于早期HCV感染的HCV核心抗原的检测。因此，本发明的目的在于提供一种丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程融合蛋白抗原及其制备方法和应用、编码该融合蛋白抗原的DNA分子、包含该DNA分子的表达载体，以及被该表达载体转化的原核宿主细胞。

本发明的目的是这样实现的：

一种人丙型肝炎病毒核心抗原，它为多肽或蛋白分子，所述的多肽或蛋白分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。

一种DNA分子，它编码上述的多肽或蛋白分子。

在本发明的一个较佳的实施例中，上述的DNA分子编码所述多肽或蛋白分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示。

一种表达载体，包含有上述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列。

一种原核宿主细胞，它被上述的表达载体转化。优选地，所述的原核宿主细胞是大肠杆菌。进一步优选地，所述的原核宿主细胞是大肠杆菌BL21。

试验证明，上述的人丙型肝炎病毒核心抗原可以用于制备诊断丙型肝炎病毒的试剂或药物。

一种制备上述人丙型肝炎病毒核心抗原的方法，包括如下步骤：

（1）提供一表达载体，该表达载体含有权利要求2所述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列；

（2）用步骤（1）所述的表达载体转化原核宿主细胞；

（3）在适合所述的多肽或蛋白分子抗原表达的条件下培养步骤（2）所得的原核宿主细胞；

（4）分离纯化获得所述的多肽或蛋白分子抗原。