[发明专利]一种稳定性高的人源抗VEGF抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质工程领域，尤其是涉及治疗用人源抗血管内皮细胞生长因子（VEGF）抗体的体外热稳定性改造，具体地，涉及针对一株抗VEGF人源抗体，通过计算机分子模拟技术对抗体进行结构模建，并对影响抗体结构稳定性的氨基酸进行定点突变，通过实验对突变体进行亲和力和热稳定性的评价，筛选获得了热稳定性明显提高的突变体抗体。

背景技术

与其他蛋白药物相比，抗体药物具有结构稳定、易于表达纯化、易于储存及体内半衰期长等特点，这也是其成为生物制药领域领军力量的重要原因之一。抗体的结构稳定性是影响其能否成为一个好的临床药物分子的重要因素之一，良好的结构稳定性是维持抗体与抗原特异性结合能力的基础。抗体结构稳定性研究不仅是生物物理学中蛋白质折叠理论的重要组成部分，也是治疗性抗体开发过程中必须面对的问题。结构稳定性不仅影响抗体的表达、纯化和储存，也影响其在体内与靶标抗原结合的亲和力和特异性，从而导致其体内生物学活性的丢失或毒副作用的增加。

人们对抗体稳定性的关注伴随着治疗性抗体产业的整个发展过程。对影响抗体结构稳定性的因素以及引发其结构不稳定的机制也进行了较深入的研究。热失活是抗体结构的不稳定最常见的形式，评价抗体抗热失活能力是评价其结构稳定性的重要指标。

抗体的热稳定性从本质上是指，抗体的天然态（Native state）与其去折叠态（Unfolded state）之间的自由能之差，即折叠自由能。理论上，抗体热稳定性越高，其抗热失活能力越强，这对抗体的开发具体重要的意义。首先，抗体的热稳性越高，则其新生肽链在细胞内装配时产生错折叠（mis-folding）的概率越低，从而可溶性表达量也越高。因此，提高抗体的稳定性，可以大幅降低生产成本，从而使得药物便于普及。其次，近十年的研究还表明，抗体的热稳定性与其在体内对各种蛋白酶的耐受性是相关的。抗体热稳定性越高，则其结构折叠的越紧凑，进而其内部的蛋白酶切位点越不容易暴露在外，因此在体内越不容易被蛋白酶降解，从而使得其在相同体内清除速度下在体内的剩下有效成分越多，而这在客观上使得在给药剂量相同的情况下其血药浓度越高。更重要的是，抗体的稳定性是其行使正确生物学功能的保障，抗体稳定性越高，其在体内保持生物活性的时间也越长。由此可见，较高的热稳定性，是一株治疗性抗体能否最终走上临床并投放市场的关键因素之一。除此以外，抗体的热稳定性对于其保质期及存放条件等性质也是至关重要的。热稳定越高，则在相同条件下的保存时间也就越长，而且对保存环境的要求也相对较低——而这在一定程度上也降低了抗体的储存和物流成本。因此，在保证抗体亲和力、特异性及表达量等性质不受太大影响的情况下，最大程度上提高其热稳定性，对于抗体药物研发具有重要的现实意义与应用价值。

目前，针对抗体稳定性改造的比较经典的几种方法包括：CDR移植的方法，基于晶体结构的计算机辅助分子设计、基于抗体同源模建的计算机辅助分子设计、基于蛋白质折叠理论指导下的分子改造策略以及基于已有结构知识的分子改造策略等。在以往的研究中，针对抗体稳定性改造成功的报道很多，其所采用的方法也不尽相同。通过上述的一种或几种方法的应用，均有成功案例的报道。尽管这些技术方法还未形成成熟的技术体系，但这些研究却为更深入的了解抗体结构稳定性提供了大量的素材。

由于抗体包括轻、重链两条链，因此其结构比较复杂，其整体结构的稳定性取决于：轻链和重链各自的稳定性、轻重链之间的界面稳定性及铰链区稳定性等几个方面，而轻重链的稳定性又细分为局部稳定性和整体稳定性。从影响蛋白结构稳定性的影响因素分析，影响局部稳定性因素包括局部结构熵、折叠和去折叠自由能、β转角位置及类型、特殊氨基酸如Pro和Gly所处位置是否合理、内部和表面氨基酸与其所处环境十分和谐及增加关键部位的氢键和其他有利于结构稳定的作用力等，而分子的整体稳定性除了取决于局部稳定性之外，还应考虑分子整体的去折叠次序和去折叠能量势垒等分子的热动力学特征。这些都是指导抗体稳定性改造的重要思路和技术方法。