[发明专利]一种谷氨酸棒杆菌基因及其突变基因的原核表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高新生物技术，尤其涉及一种谷氨酸棒杆菌基因及其突变基因的原核表达方法。

背景技术

在细菌和植物中，由公共途径莽草酸途径以及三个专一性途径分别合成色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸三种芳香族氨基酸，公共途径第一步反应，被认为是芳香族氨基酸合成的限速步骤，由DAHP合成酶催化。目前，对谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)DAHPSCgTyr的立体结构还未见报道，但大肠杆菌Escherichia coli、海栖热袍菌Thermotoga maritima、啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae的(β/α)8立体桶状结构均以报道，这些来源不同的DAHPS高度同源，功能相同，只是受不同底物的反馈抑制，但底物抑制的结合位点基本相同，表明它们可能是由同一个桶状结构的祖先进化而来，或者是由不定的结构收敛进化到同一种稳定的三维结构的结果，或者是二者兼有的结果。

1991年的大肠杆菌中进化高度保守的苯丙氨酸反馈抑制的DAHPS的(DAHPSEcPhe)金属离子结合位点Cys61、Glu302、Asp326、Lys97中的Cys61进行突变研究，结果该氨基酸的突变导致酶活性丧失，推测谷氨酸棒杆菌酪氨酸反馈抑制的DAHPSCgTyr活性同样对金属离子也有依赖性，保守N末端Cys69的突变，可能也会导致酶活性丧失。1999、2002年，研究人员根据AroG-PEP-(Pb2+、Mn2+)共结晶的晶体结构指出了Glu24、Lys25、Arg124、His217对DAHPSEcPhe的四连体结构起到重要的作用，从DAHPSCgTyr氨基酸序列分析发现这几个氨基酸进化过程中并不保守，预示DAHPSCgTyr不是四连体结构，可能是以紧密的二聚体结构存在。研究人员确定了DAHPSEcPhe的活性中心位于(β/α)8桶的C末端，由于PEP和E4P都是带有负电的反应底物，所以在活性中心附近带正电荷的氨基酸比负电荷的多，在距离Pb2+8A范围内多为Arg和Lys，而DAHPSCgTyr中这些带电的氨基酸都是高度保守的，说明DAHPSCgTyr的活性中心位置与DAHPSEcPhe基本相同，但对这些带正电的Arg和Lys的突变研究鲜见报道。研究人员还认为DAHPSEcPhe反馈抑制子苯丙氨酸的苯环结合在氨基酸Phe144、Pro150、Leu175和Leu179的侧链形成疏水“pocket”的底部，苯丙氨酸结合这些氨基酸以后，引起一些氨基酸残基间的新接触的形成以及原有接触的破坏，引起酶催化活性的降低，而在DAHPSCgTyr氨基酸序列中没有保守的Leu179(E.Coli)，而对应为Met，其余几个氨基酸均保守，固推测是该位氨基酸在进化过程中的改变，导致反馈抑制子的不同。

我国研究人员确定大肠杆菌DAHPSEcPhe Leu175的所有突变体的比活都比野生型高，并部分或完全解除反馈抑制。本研究对与大肠杆菌AroG基因Leu175相对应的谷氨酸棒杆菌aro I基因Leu183进行突变，所得突变体L183Q比活同样比野生型高，分析原因可能是该氨基酸残基的突变使得反馈抑制子酪氨酸不易结合，或是底物PEP更容易结合到活性位点，或是另一个底物E4P更容易与已结合在活性位点的PEP发生反应，但具体原因还有待于深入研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供了一种谷氨酸棒杆菌AroI基因及突变基因AroI*的原核表达方法。

为解决上述技术问题，本发明通过以下方案来实现：谷氨酸棒杆菌基因及其突变基因的原核表达方法，所述方法所使用的材料为菌株大肠杆菌BL21及pET-28a(+)原核表达载体，由以下步骤实现：

1)、DAHP合成酶基因及突变基因的原核表达载体构建；

2)、目的基因与表达载体pET-28a(+)的酶切，限制性内切酶Nde I和XhoI双酶切重组质粒pMD18T-simple-Aro I和pMD18T-simple-Aro I*，回收目的基因片段，分别按照下表中体系进行加样，对目的基因和pET-28a(+)载体于37℃恒温4h进行双酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察电泳结果，回收目的基因和载体的目的片段；

3)、回收片段的连接，将回收的带有粘性末端的AroI和AroI*基因的ORF片段及载体片段用T4 DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜，采用柱离心琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，回收的DNA贮存于-20℃；