[发明专利]一种斑点杂交检测方法

权利要求书

1.一种斑点杂交检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

将含有DNA样品的杂交膜封入杂交袋中并加入杂交溶液，封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点；

将所述杂交膜置于烧杯，加入冲洗溶液于摇床中洗膜，洗去未结合的探针并封闭所述杂交膜上非特异性的蛋白质结合位点；

取出所述杂交膜置于平皿中，加入含有抗地高辛抗体的马来酸缓冲液中，使酶联抗体与地高辛相结合并洗去未结合的酶联抗体；

将所述杂交膜置于显色液中显色，使用无酶水终止反应。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杂交膜根据大小剪取的尼龙膜，置于无酶水中漂洗，将尼龙膜完全湿润，取出后再浸泡于柠檬酸钠冲洗缓冲液中，并置于灭菌纸上于室温干燥，所述柠檬酸钠冲洗缓冲液由氯化钠及柠檬酸钠构成，溶于无酶水中，用氢氧化钠固体将pH调至7.0，于室温保存。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA样品经过14mins的煮沸，快速放入冰水中，骤冷10mins后置于杂交膜的毛面上并放在120℃的烘箱中30mins。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述加入的杂交溶液至杂交膜漂起为止，除去气泡，置于37～42℃恒温摇床，振摇1小时。

5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述杂交溶液包括去离子甲酰胺、柠檬酸钠冲洗缓冲液、阻断溶液、十二烷基磺酸钠、磷酸氢二钠及硫酸葡聚糖。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗去未结合的探针并封闭所述杂交膜上非特异性的蛋白质结合位点具体包括：

将所述杂交膜放入烧杯中，加入冲洗溶液，在摇床中洗膜；

取出所述杂交膜，在含有预热冲洗缓冲液的平皿中浸泡，转入10％马来酸缓冲液中，室温作用1小时。

7.如权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述马来酸缓冲液包括马来酸及氯化钠，溶于无酶水中，用氢氧化钠固体将PH调为7.5并用无酶水定容，室温保存。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针为特异性引物，其制备方法具体包括如下步骤：

将绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因与长末端重复区的U3基因序列反转录聚合酶链式反应产物纯化并测定含量，于-20℃保存；

依据地高辛标记及试剂盒检测进行囊膜基因和U3基因序列探针的标记，并于-20℃保存；

检测标记特异性探针的灵敏度。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述检测所述标记特异性探针的灵敏度的步骤具体包括：

将地高辛标记的产物和DNA样品进行浓度梯度稀释；

取不同浓度1μL平行点至尼龙膜上，120℃烘焙30mins后显色，根据所述尼龙膜上出现的斑点与所述DNA样品出现的斑点对照，确定探针的灵敏度。