[发明专利]一种酶法不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种羰酰还原酶在不对称还原羰基化合物中的应用，尤其涉及一种羰酰还原酶(Carbonyl Reductase CR)在以4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）为前手性底物不对称合成(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用。 

  

背景技术

手性醇(Chiral Alcohols)在手性药物、农用化学品以及多种类型的手性材料制备中有广泛应用。手性醇可由前手性烯烃的不对称硼氢化–氧化、前手性羰基化合物的不对称催化氢化、不对称还原前手性羰基化合物等多种途径制备。 

以(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯[(S)-CHBE]为例， (S)-CHBE可用于很多活性药物的合成，它是对映体选择性合成Slagenins B和C以及他汀类药物——羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA) 还原酶抑制剂的关键手性中间体，而且(S)-CHBE还可以转化生成1,4-二氢吡啶类β-阻滞剂^[1]。 

迄今为止，(S)-CHBE已经通过手性钌或铑等金属催化的不对称还原和生物催化法合成。利用化学转化的方式适合工业大规模生产，但是其缺点是催化剂价格昂贵，反应条件苛刻，催化过程需要很高的氢气压力，对设备要求高，产物的光学纯度不理想，达不到手性药物中间体的制备要求。 

与化学法相比，生物催化法往往具有高效率、高立体选择性、反应条件温和以及经济和社会效益好等优点。尤其是采用羰酰还原酶生物催化法不对称还原COBE制备(S)-CHBE 受到普遍关注^[2]。 

目前已报道了细菌、酵母和霉菌等多种微生物能够催化底物COBE为手性的CHBE，但野生的菌株往往显示出较低的对映体过量值(enantiomeric excess, e.e.)值。解决上述问题的方法之一是筛选到优良的菌种，京都大学^[3]和江南大学分别筛选到了木兰假丝酵母(Candida magnoliae)和出芽短埂霉(Aureobasidium pullulans)CGMCC1244，所制备(S)-CHBE的e.e.值均在97%以上。另一种切实可行的方法是将一个还原酶克隆到一个不能催化底物COBE的宿主中。Kizaki等从木兰假丝酵母中克隆了羰酰还原酶S1，在大肠杆菌中进行表达后，对底物COBE有极高的活性及立体选择性，在添加适量的NADP⁺后，产物(S)-CHBE在有机相中的浓度可达2.58 M，光学活性为100%，辅酶循环的转化数为21600^[4]。由于催化COBE为(S)-CHBE的酶都属于氧化还原酶，使用氧化还原酶进行生物催化时，合成产物的同时会消耗一定量的辅酶。而这些辅酶往往价格昂贵、稳定性低、从技术经济角度考虑，投加大量辅酶是不可行的。因此，Shimizu等通过克隆脱氢酶的方式，将葡萄糖脱氢酶在重组大肠杆菌中进行表达，避免了添加商业化购买的葡萄糖脱氢酶，并实现辅酶的原位再生^[5]。华东理工大学的许建和等从蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）中获得一条依赖于NADH 的羰酰还原酶 ScCR，在大肠杆菌中表达后，并添加适量的辅酶NAD⁺，辅底物异丙醇后，利用水-甲苯的两相反应体系及底物耦合的辅酶循环系统产生了3.6 M 的(S)-CHBE，光学纯度大于99%^[6]。上述提及的两种辅酶循环系统在目前应用的过程中仍需要额外添加一定量的辅酶NAD(P)⁺/NAD(P)H，这在很大程度上提高了生产成本。南京工业大学安明东等从白色念珠菌（Candida albicans）中获得一条依赖于NADPH 的山梨糖还原酶SOU1，发掘了SOU1用于底物耦合的潜在辅底物山梨醇、甘露醇以及木糖醇，扩大了SOU1在底物耦合辅酶循环系统中的应用，并在未额外添加辅酶情况下，实现了 (S)-CHBE的不对称合成^[7]。 

    综上所述，现有生物催化COBE为(S)-CHBE的技术得到进一步的发展，但是为扩大工业化生产，现有技术仍存在羰酰还原酶对底物耐受性差、酶的重复利用率低、产物得率低、生产成本高等问题。