[发明专利]重组乳铁蛋白二肽、表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种重组乳铁蛋白二肽、表达载体及其应用，具体涉及一种根据毕赤酵母密码子的偏好性优化重组的乳铁蛋白二肽和包含该重组乳铁蛋白二肽的表达载体及其构建，以及将该重组乳铁蛋白二肽作为一种新型绿色饲料添加剂在动物饲料中的应用。

背景技术

抗生素作为抗菌促生长添加剂加到饲料中由来以久，但其广泛和大量使用导致动物性食品中药物残留等问题愈来愈令人担忧。限制抗生素的使用已不可逆转，如何寻找抗生素的替代品已成为各国动物营养学家最为关注的焦点。因此寻找一种安全、环保的新型饲料添加剂已成为当务之急。

近年来，乳铁蛋白（Lactoferrin，简称LF）成为当今乳品界和食品界最为关注的“热点”之一。大量研究表明：乳铁蛋白具有抗菌、抑菌、抗病毒、抗氧化和调节机体免疫等作用，可用于开发新型的保健食品和绿色饲料添加剂。乳铁蛋白活性多肽是乳铁蛋白在酸性条件下的降解产物，其抗菌活性明显提高。

牛乳铁蛋白肽（LfcinB）是从乳铁蛋白的N-端（17-41）被胃蛋白酶水解下来的25个氨基酸残基的小肽，分子量3100Da，序列为FKCRR WQWRM KKLGA PSITC VRRAF。其中的11个氨基酸残基（RR WQWRM KKL）具有与完整的LfcinB相同的抗菌活性，11个氨基酸残基中的6个（RR WQWR）是LfcinB的活性中心。

另一种乳铁蛋白活性多肽Lactoferrampin（Lfampin）来源于乳铁蛋白N端的第265-284位氨基酸，序列为DLIWKLLSKAQEKFGKNKSR，分子量2389Da，研究表明其具有与LF、LfcinB相似的生物学活性，即抗菌、抗病毒、抑制癌细胞生长、消炎及参与免疫反应等。

近年来，研究发现小分子多肽乳铁蛋白二肽Lfchimera（由LFcinB17-30和LFampin265-284组合而成，序列为N-FKCRRWQWRMKKLG-K-RSKNKGFKEQAKSLLKWILD-N，分子量4422Da）具有比LFcinB17-30、LFampin265-284及其1:1混合物更强的抑菌活性，同时作用时间更短（<15min），也能耐受更高的盐度（>100mM NaCl）。

随着多肽化学合成技术日趋完善，利用多肽自动合成仪可以准确合成一定氨基酸顺序的多肽，该技术用于少量合成Lfcin及其多种衍生物，是研究Lfcin活性与结构关系、明确Lfcin作用机制、调节Lfcin的功能以及开发具有特定功能与性质的Lfcin衍生物的重要方法与手段。但该方法合成的Lfcin价格十分昂贵，仅使用于实验室的小量制备。

利用基因工程生产乳铁蛋白活性多肽具有广阔的应用前景，利用DNA合成仪直接合成编码该多肽的DNA，并构建表达载体，在乳腺反应器或微生物中高效表达具可行性。但由于乳铁蛋白活性多肽抗菌谱广，宿主表达的活性多肽可能会对微生物宿主本身产生反馈性抑制作用，达不到高效表达的理想结果；因此构建表达体系的同时，要考虑筛选具有一定抗性的宿主微生物，这虽然增加了基因工程生产的难度，但因生物技术的迅速发展，仍不失为实现乳铁蛋白活性多肽产业化最有希望的途径之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种优化后的高活性重组乳铁蛋白二肽、表达载体及其应用。

为了使乳铁蛋白二肽基因Lfchimera在重组毕赤酵母表达系统中更高效的转录、翻译、表达，本发明根据毕赤酵母密码子的偏好性，将现有的乳铁蛋白二肽Lfchimera（GenBank:X54801.1，SEQ ID No.1）中的酵母低频密码子优化成高频密码子，进行引物设计，并经PCR扩增进行人工合成。经序列测定，优化后的重组乳铁蛋白二肽Lfchimera的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

其中，所设计的引物序列如下：

上游引物P1：5’-GGCGAATTCTTTAAGTGTCGACGATGGCAATGGA-3’

下游引物P2：5’-GGCGCGGCCGCATCCAAAATCCACTTAAGAAGAGAC-3’