[发明专利]抗纹枯病基因关联抗病同源序列及其分子标记获取方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物抗病基因的植物基因工程以及分子标记辅助育种领域，具体涉及抗纹枯病基因的抗病基因同源序列及其分子标记，及其专用引物在水稻抗纹枯病中的应用。 

背景技术

水稻纹枯病是由枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn）侵染而引发的一种真菌病害，世界各个稻区都有不同程度的发生。该病害可在水稻整个生育期都可发病，一般造成水稻减产10～30%，严重时可达50%。近年来，由于高产品种的推广，种植密度的提高，氮肥施用量的增加，水稻纹枯病的危害日益严重，已成为我国南方稻区的第一大病害。 

由于使用抗病品种防治纹枯病被认为最经济、最有效和对环境最友好的方式，因而对水稻纹枯病抗性基因研究成为热点，目前已定位的纹枯病抗性数量位点（Quantitative TraitLoci,QTL）约有90多个。不过，由于纹枯病抗性属于数量性状，而且纹枯病抗性QTLs的定位多是利用非基因功能的分子标记，例如微卫星标记（SSR），因此这些分子标记在抗纹枯病育种上利用价值不高。 

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻抗纹枯病基因位点分子标记，通过检测这些与抗纹枯病关联的分子标记，可以预测水稻植株的纹枯病抗性，加快抗纹枯病水稻新品种的选育速度，简化选育手段。 

本发明实施例是这样实现的，抗纹枯病基因关联抗病同源序列及其分子标记获取方法，该获取方法包括：引物及其序列、水稻抗纹枯病关联RGA引物及其产生的抗病同源序列片段以及相对应的抗病同源序列在Rice Genome Annotatation Project上的注释号、编码的蛋白质，具体为： 

进一步，抗纹枯病基因关联抗病同源序列及其分子标记获取方法如下： 

RGA引物设计，根据从Rice Genome AnnotatationProject(http://rice.plantbiology.msu.edu/)上检索到的全基因组抗病同源序列，利用引物设计软件PrimerPremier6设计了水稻全基因组RGA引物； 

178份全球核心种质RGA基因型鉴定，用CTAB法提取137份全球核心种质的DNA，用1.中设计的备选RGA标记178份全球核心种质进行RGA基因型分析，PCR反应在NBI Veriti9600扩增仪上进行，扩增产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，并记录带型； 

178份全球核心种质抗纹枯病表型，利用纹枯病病菌微管快速鉴定技术，对178份核心种质接种鉴定；抗性对照品种为Jasmine85，感病对照品种为Lemont；每个品种选3株，设三次重复；当感病品种Lemont的发病指数达90%时，记录每个品种的发病情况； 

分子性状关联分析，利用单分子标记分析方法进行分子性状关联分析，取P≤0.001，获得RGA4、RGA218、RGA320、RGA378、RGA470、RGA50和RGA468与纹枯病抗性相关联； 

利用关联RGA标记相对应抗病同源序列测序及比对，利用关联RGA标记对纹枯病抗感种质进行克隆测序。 

进一步，关联RGA标记相对应抗病同源序列测序及比对，利用关联RGA标记对纹枯病抗感种质进行克隆测序具体过程如下: 

抗病同源序列克隆PCR扩增体系50μl：1μl DNA,10×buffer5μl，10mM dNTP2μl,10μM引物各3μl，高保真Taq酶0.5，超纯水35.5μl； 

PCR反应程序：94℃5min;95℃20s,57℃45s,72℃1min,共35个循环；然后72℃延长7min；最后4℃保存； 

PCR产物在1%琼脂糖电泳分离，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。再将用将目的片段构建到宝生物工程有限公司生产的PMD19T质粒载体，然后将构建好的载体转化到感受态大肠杆菌DH5α中，最后送样测序。 

进一步，序列比对分析，序列RGA742共588bp，通过在线软件对抗感种质的PCR片段比对发现两者存在9个碱基缺失；编码一个144个氨基酸的P-loopNTPase超级家族；通过比对，RGA742与LOC_Os01g52550在30253614bp之间95%的同源；