[发明专利]高效裂解串联基因，高效裂解质粒及构建方法和应用

说明书

技术领域    

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种由噬菌体PhiX174突变裂解基因mE和葡萄球菌核酸酶A基因SNA组成的高效裂解串联基因，含有此高效裂解串联基因的高效裂解质粒及构建方法，还涉及所述高效裂解质粒在制备菌蜕中的应用。

背景技术   

细菌菌蜕（Bacterial Ghosts, BGs）是革兰氏阴性菌被噬菌体PhiX174的裂解蛋白E裂解后形成的完整的细菌空壳。裂解蛋白E是由91个氨基酸组成的疏水跨膜蛋白，其本身不具有任何酶的活性，但可通过寡聚化介导跨膜孔道的形成。孔道形成后，在细胞内高渗透压的作用下革兰氏阴性菌的大部分胞质内容物由孔道排出，从而形成不含核酸、核糖体及其它组分的细菌空壳。这种非变性的基因灭活方式使菌蜕完好地保留了细菌的各种表面抗原成分和免疫粘附分子。因此，菌蜕不仅可以直接作为疫苗使用，而且还可作为递呈异源抗原的重组疫苗及作为核酸疫苗甚至药物的递送载体。

细菌菌蜕的形成是通过对裂解基因E的严格表达调控实现的，应用最广泛的是λpL/pR-cI857 温控表达系统。基因E的温控表达介导的细菌裂解已经成功地应用于很多革兰氏阴性菌，例如：大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、幽门螺旋杆菌、胸膜肺炎放射杆菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌、巴氏杆菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、爱德华菌等。因此，推测只要将基因E裂解框引入到合适的载体中，E蛋白介导的裂解可能会在每种革兰氏阴性菌中发生。 

然而，E蛋白介导的裂解过程依赖于宿主细菌的生长状态，要求宿主细菌处于对数生长中期，OD₆₀₀值在0.2～0.6之间，这致使菌蜕的产量偏低，限制了菌蜕的大规模生产。即使宿主细菌处于对数生长中期，E蛋白介导的裂解过程并不能使所有细菌失活。有研究应用流式细胞术监控大肠杆菌菌蜕的形成，在菌蜕制剂中未裂解的可繁殖细胞最低比率也达到1%，还存在约4%裂解不完全的失活细胞。在这些未裂解和裂解不完全的失活细胞中存在着大量的细菌遗传物质，使菌蜕存在着病原决定簇基因或抗生素基因侧向传播的风险。 

菌蜕要作为疫苗或分子递送载体使用，必须克服裂解效率低、产量低及菌蜕中存在的不安全因素等难题。因此，本领域需要更为安全、高效的裂解质粒，并应用该质粒制备安全的菌蜕制剂。 

发明内容

针对上述背景技术中提到的裂解效率低、产量低及菌蜕中存在的不安全因素等问题，本发明提供了一种由噬菌体PhiX174突变裂解基因mE和葡萄球菌核酸酶A基因SNA组成的高效裂解串联基因，含有此高效裂解串联基因的高效裂解质粒及构建方法。 

本发明还提供了所述高效裂解质粒在制备菌蜕中的应用。 

本发明是通过以下方式实现的： 

一种由噬菌体PhiX174突变裂解基因mE和葡萄球菌核酸酶A基因SNA组成的高效裂解串联基因，基因序列如序列表中序列3所示。

含有上述所述的高效裂解串联基因的高效裂解质粒。 

所述的高效裂解质粒，将所述的高效裂解串联基因酶切后插入pBV220载体中。 

所述的高效裂解质粒的构建方法，包括以下步骤： 

（1）以噬菌体PhiX174 RFI DNA为模板、以序列表中的序列4和序列5为引物进行PCR扩增，获得突变裂解基因E；

（2）以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板、序列表中序列6和序列7为引物进行PCR扩增，获得葡萄球菌核酸酶A基因；

（3）将步骤（1）中得到的突变裂解基因E和步骤（2）中得到的葡萄球菌核酸酶A基因作为下一步PCR反应的模板，用序列表中的序列4和序列7进行扩增，得到串联基因；

（4）将串联基因应用EcoR I和Sal I限制性内切酶进行双酶切，酶切产物与经EcoR I和SalI双酶切的pBV220载体连接，得到高效裂解质粒。

将步骤（4）得到的高效裂解质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，30℃过夜培养16 h，挑取单菌落于氨苄青霉素抗性的LB培养基中30℃过夜振荡培养，提取质粒，保留鉴定为阳性的质粒。 

所述的高效裂解质粒在制备菌蜕中的应用。 

所述的菌蜕优选为肠杆菌科的菌蜕。 

所述的应用，包括以下步骤： 

（1）将含有高效裂解质粒的大肠杆菌DH5α在30℃培养至OD₆₀₀值达到1.0-1.2；

（2）培养温度升高至42℃诱导高效裂解串联基因的表达；