[发明专利]用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种水产药物的筛选方法，具体涉及一种用四氯化碳（CCl₄）诱导鲤鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法。

背景技术

以肝损伤为主要特征的鱼类肝胆综合症是目前水产养殖中日趋严重的病害，其发病范围广，死亡率高，给水产养殖业造成极大的经济损失。

鱼类肝胆综合症属非传染性疾病，常用的抗生素和抗病毒等药物不能有效地控制鱼类肝胆综合症，该病目前还没有有效的治疗方法。

中国专利201110260881.7公开了一种用四氯化碳（CCl₄）诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法。该方法将受试药物添加到饲料中对实验鱼进行1-2个月的喂养，然后用CCl₄损伤肝脏造模，再将大量的实验鱼屠宰取样。该方法虽然直观地反映了受试药物的保肝效果，但是实验周期长，对实验动物和受试药物的需求量大，需要花费大量的人力、物力和财力。因此不适用于保肝药物的初步筛选，尤其是早期的大规模筛选。

基于细胞的体外药物筛选具有所需实验动物和受试药物用量少、药物作用机制明确，可实现大规模筛选等特点，已被广泛应用于人类药物的筛选。原代细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大，是检测药物很好的实验对象。中国专利201010169846.x公开了一种用肝原代细胞作为载体的高通量药物筛选的方法。但基于原代肝细胞培养的体外药物筛选目前还没有应用到鱼类保肝药物的筛选中。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对水产养殖中日趋严重的以肝损伤为主要特征的鱼类肝胆综合症，克服现有技术的不足，提供一种用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法。

为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，具体包括以下步骤：

（1）分离鲤鱼原代肝细胞，用L-15培养基将原代肝细胞的细胞浓度进行调整，将所述原代肝细胞种于细胞培养板上并进行培养，将所述原代肝细胞随机分为正常对照组、CCl₄模型对照组、受试药物组；

（2）所述原代肝细胞贴壁后，更换培养基，正常对照组和CCl₄模型对照组继续用L-15培养基培养，受试药物组用含不同浓度受试药物的L-15培养基培养；2-6小时后，弃上清液，正常对照组加L-15培养基，其余各组加含4-16mMCCl₄的L-15培养基；2-6小时后，收集上清液，检测该上清液中的GPT、GOT和LDH水平，根据GPT、GOT和LDH的变化评价受试药物保护肝细胞的药效。

作为本发明所述用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法的一种优选方案，其中步骤（1）中用胰酶消化法分离鲤鱼原代肝细胞，所述L-15培养基中FBS的含量为10%，用含10%FBS的L-15培养基将原代肝细胞的细胞浓度调整为2*10⁵/mL，按照600μL/孔将所述原代肝细胞种于所述细胞培养板上，培养24小时。

作为本发明所述用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法的一种优选方案，其中步骤（2）中的造模浓度为8mM的CCl₄。因为CCl₄的浓度如果太高，会对肝细胞造成严重的毒性，导致肝细胞的死亡，从而使造模失败；如果CCl₄的浓度如果太低，不足以造成对肝细胞的损伤，也不能得到符合要求的肝细胞损伤模型，本发明通过对不同浓度的CCl₄浓度进行筛选，以上清液中的GPT、GOT和LDH水平为指标，得出最佳造模所需的CCl₄浓度为8mM。

作为本发明所述用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法的一种优选方案，其中步骤（2）所述的造模时间为4小时，因为如果造模时间短，肝细胞培养上清液中的GPT、GOT和LDH没有发生显著变化，不符合造模要求，但是如果造模时间太长，肝细胞培养上清液中的GPT、GOT和LDH也没有显著差异，同样不符合造模要求，本发明通过对不同的造模时间进行筛选，确定CCl₄造模的最佳时间为4小时。

作为本发明所述用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法的一种优选方案，其中步骤（2）受试药物包括多种，每种受试药物设3-5个剂量梯度，每种受试药物的每个剂量对应一个受试药物组，对每一个受试药物组用对应剂量的受试药物与肝细胞共培养。