[发明专利]稳定表达6个HMW-GS的普通小麦培育方法

权利要求书

1.一种稳定表达6个HMW-GS的普通小麦培育方法，其特征在于：以普通小麦为母本，野生二粒小麦为父本，将拥有4个HMW-GS的野生二粒小麦的花粉，授予六倍体的普通小麦，通过种间远缘杂交、多代自交及鉴定，选育出稳定表达6个HMW-GS的普通小麦。

2. 根据权利要求1所述的稳定表达6个HMW-GS的普通小麦培育方法，其特征在于：所述母本选自高产但加工品质差的普通小麦，染色体组型为AABBDD，具有4个高分子量谷蛋白亚基，其1Ay亚基编码基因处于沉默态，具有序列表中SEQ ID NO.1-3所述的碱基、核苷酸及氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的稳定表达6个HMW-GS的普通小麦培育方法，其特征在于：所述父本选自Glu-A1和Glu-B1位点均表达的含有4个高分子量谷蛋白亚基的野生二粒小麦，染色体组型为AABB，其活性态的1Ay亚基基因具有序列表中SEQ ID NO.4-5所述的碱基、核苷酸及氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的稳定表达6个HMW-GS的普通小麦培育方法，其特征在于：所述双亲的杂交，是抽穗后对母本穗进行人工去雄，套上硫酸纸袋以防飞花，授以野生二粒小麦花粉后继续套袋直至成熟。

5.根据权利要求1所述的稳定表达6个HMW-GS的普通小麦培育方法，其特征在于：所述多代自交及鉴定包括如下方法步骤：

A、将经杂交产生的种子进行SDS-PAGE分析，并对其根尖体细胞染色体数目进行检测，选择具有双亲HMW-GS条带的、染色体数目为35条的杂种F₁代植株；

B、将经步骤A选取出的F₁代植株在抽穗后套上硫酸纸袋自交，收取F₂代种子，按步骤A所述方法进行SDS-PAGE分析和染色体数目检测，选取35≤2n≤42和HMW-GS为6条的籽粒继续种植套袋自交得F₃代，再按步骤A所述方法对F₃代籽粒进行检测和选取；

C、对步骤B获选的F₃代种子进行发芽移栽，并自交，连续自交6代后获得F₈代，且每代均选取株叶型、抽穗期、开花期、成熟期趋向母本普通小麦的单株；

D、随机抽取F₈代单株， 再从各单株收获籽粒中随机选取8粒，按步骤A所述的SDS-PAGE方法进行HMW-GS检测；选取具有6个HMW-GS的籽粒进行发苗移栽获得F₉代植株，再自交，收获F₉代植株上产生的F₁₀代籽粒，再随机选取8粒按同样方法进行SDS-PAGE分析，对HMW谷蛋白亚基进行检测；然后再对HMW谷蛋白亚基谱带数均为6条，且电泳迁移率一致，并含有父本野生二粒小麦Glu-A1和Glu-B1位点y-型亚基的上述8粒籽粒，进一步按步骤A所述方法进行染色体数目均为2n=42的根尖染色体数目检测；

E、将步骤D选取的杂种F₁₀代种子，同时与母本及父本的种子进行室内发芽，剪取幼嫩叶片提取基因组DNA，然后对HMW-GS编码基因进行PCR扩增，选取1Ay的条带进行转化、阳性检测、测序和序列比较分析；

F、将步骤E获得的F₁₀代种子与母本及父本的核苷酸及其氨基酸序列进行比较分析，确认杂种育成小麦的Glu-A1位点活性y型亚基编码基因与父本野生二粒小麦的Glu-A1位点活性y型亚基编码基因序列高度一致，均具有1830bp的核苷酸长度，都没有缺失/插入区段，都能编码608个氨基酸残基，且没有提前终止密码子，均属于活性态的Ay基因；而母本普通小麦Ay等位基因的核苷酸序列短于父本和育成小麦，为1791bp，而且其DNA分子结构上存在着3个区段的缺失，其中间重复区还存在1个提前终止密码子，处于沉默态，由此而确定野生二粒小麦Glu-A1位点的活性y型亚基编码基因已真实导入普通小麦基因组；

G、对步骤F鉴定的杂种后代中的活性Ay等位基因进行染色体工程遗传重组特性分析，确认育成普通小麦所拥有的活性Ay基因的DNA序列，在保持父本98.9%的1Ay基因核苷酸的同时，还存在21个单核苷酸的变异，其中14个位点为突变，7个位点为整合了母本普通小麦的核苷酸；

H、对经步骤G确定的育成普通小麦的1Ay基因的编码亚基活性进行异源表达分析，以证明育成普通小麦所拥有的1Ay 基因与父本野生二粒小麦的1Ay基因一样具有编码1Ay亚基的功能；

I、将经步骤D-H鉴定后获选的杂种种子的具有种胚的半粒进行培养皿内发芽移栽，再连续自交2代获得F₁₁和F₁₂代；继续对F₁₁和F₁₂代的籽粒按步骤A的SDS-PAGE方法进行HMW-GS检测，以进一步证明其拥有的6个HMW-GS能在普通小麦遗传背景中稳定传递。