[发明专利]番茄环斑病毒的RT-LAMP检测方法

说明书

技术领域

 本发明涉及番茄环斑病毒的检测技术，具体涉及番茄环斑病毒的RT-LAMP检测方法。

背景技术

番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)属于豇豆花叶病毒科（Comoviridae)线虫传多面体病毒属（Nepovirus）的RNA病毒,为我国对外公布的禁止进境检疫性有害生物，其寄主范围广，据报道可侵染35科105属157种以上的植物。它是侵染百合、葡萄、苹果、玫瑰、唐菖蒲、水仙、大丽花、兰花番茄、菜豆、黄瓜和烟草等经济作物的重要致病病原。目前，国内外针对ToRSV的检测方法，包括鉴别寄主反应（生物学方法）、电镜观察、血清学试验和核酸杂交以及PCR检测等分子生物学手段，PCR检测复杂，检测慢至少要3.5 h，灵敏度较低，检测结果判断较难。由于番茄环斑病毒的症状变化多样，常有隐症现象，均给常规诊断带来困难，甚至出现漏检，需要更加准确和灵敏的检测方法。

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）作为一种新颖的核酸扩增方法，同样具有检测速度快、操作简单和灵敏度高等优点；该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速和特异地扩增靶序列。由于LAMP呈瀑布式扩增，因此其扩增效率非常高；同时，LAMP识别靶序列上的6～8个特异性位点，其特异性也很强；LAMP只在60℃～65℃进行恒温扩增，只要水浴锅即可，无需特殊的仪器，操作非常简单；而且LAMP的整个检测反应只需1 h～2.5 h，检测周期非常短。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、操作简单、检测结果判断容易和灵敏度高的番茄环斑病毒的RT-LAMP检测方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：番茄环斑病毒的RT-LAMP检测方法，其步骤如下：

a、总RNA提取：检测样品经液氮处理后研碎成粉末状，用Trizol核酸提取试剂提取总RNA，得到样品总RNA；具体提取方法依Trizol核酸提取试剂的说明书进行；

b、RT-LAMP扩增：20μL的RT-LAMP扩增反应体系为2×反应缓冲液10μL，浓度5 U/μL 的Bst DNA聚合酶1.5μL，浓度5 U/μL 的AMV RNA聚合酶1μL，样品总RNA1 μL，引物F3、B3、Loop1、Loop2、FIP和BIP，余量为ddH₂O，该扩增反应体系中，引物F3和B3的终浓度各为0.2μM，引物Loop1和Loop2的终浓度各为0.8μM，引物FIP和BIP的终浓度各为1.6μM，其中引物F3的核苷酸序列为cagggctcga atggcact，引物B3的核苷酸序列为cctctaaaaa ggaggttgct gc，引物Loop1的核苷酸序列为tggcgcaacg ataataaaag g，引物Loop2的核苷酸序列为attttggctg acggacaagg，引物FIP的核苷酸序列为ctccaatgtg agactcggca tctttttggg acagcactta caacctgttc，引物BIP的核苷酸序列为cgcatatcaa aggccccatt ttttggtaga aattggtaat gaaaaagcc，反应条件为60～65℃的恒温水浴锅中扩增0.5～1 h，得到扩增产物； 

c、在扩增产物中加入0.1μL的荧光染料SYBR green I，若呈绿色则样品中感染有番茄环斑病毒，若呈橙红色则样品中无番茄环斑病毒。

与现有技术相比，本发明的优点在于番茄环斑病毒的RT-LAMP检测方法，通过样品RNA提取，RT-LAMP扩增，就可以得到检测结果，整个检测反应只需1 h～2.5 h，又由于LAMP呈瀑布式扩增，因此其扩增效率非常高，灵敏度是RT-PCR检测的100倍，且无需复杂的检测仪器和检测过程，操作简单，可现场实时检测，因此本发明是一种检测速度快、操作简单、检测结果判断容易和灵敏度高的番茄环斑病毒的RT-LAMP检测方法。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1