[发明专利]一种DNA分子及重组质粒和大肠杆菌

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种DNA分子及重组质粒和大肠杆菌。 

背景技术

L-苏氨酸是人体所必需的8种氨基酸之一，广泛应用于医药、食品、饲料等，目前L-苏氨酸主要以微生物发酵的方法生产，多种细菌可用于L-苏氨酸生产，如谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌等。由于大肠杆菌发酵生产L-苏氨酸具有繁殖迅速、发酵温度高、生理生化基础研究较深入的优势，逐渐成为L-苏氨酸生产的常用菌株。 

随着世界对L-苏氨酸需求量的不断增加，L-苏氨酸高产菌株的研究越来越受到重视。其中，影响大肠杆菌高产的最关键的一个因素就是其耐受L-苏氨酸的能力，只有解除L-苏氨酸对代谢途径的抑制，才能进而增加L-苏氨酸的产量。虽然野生型的大肠杆菌具有表达L-苏氨酸耐受蛋白的基因，但该基因所表达的蛋白量较低，仅为大肠杆菌正常生长所需，并不能耐受大于0.1M浓度的L-苏氨酸，使得野生型的大肠杆菌的产酸能力较低。 

因此，利用生物技术手段对野生型大肠杆菌进行改造，使其能够具有较高L-苏氨酸耐受能力，对L-苏氨酸的生产具有十分重要的意义。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种DNA分子及重组质粒和大肠杆菌，使得所述大肠杆菌对L-苏氨酸具有较高的耐受活性。 

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案： 

一种DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。 

本发明从NCBI数据库获得来自于耶尔森氏菌属-Yersinia enterocolitica subsp.enterocolitica8081菌株的一段蛋白质序列，长度为 206个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，NCBI蛋白序号为Gi：123440599，该蛋白具体功能尚未得到公开确认，而经申请人研究其具有耐受L-苏氨酸的活性，但是表达该蛋白的基因（Gene bank中的编号为FR718698.1，621bp，DNA序列3775-4395）来源于同大肠杆菌种属差异较大的耶尔森氏菌属，其在大肠杆菌中并不能正确表达该蛋白。故本发明按照大肠杆菌W3110密码子的偏好性，优化密码子，通过核酸合成仪合成核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA分子，测序验证该序列的正确性，合成基因酶切位点为SmaI/HindIII，其中优化、合成工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。 

本发明还提供一种重组质粒pKR-E，由质粒pKK223-3在其Sma Ⅰ和HindIII酶切位点间插入如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子获得，经PCR和酶切验证并测序，表明如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子已成功构建至质粒pKK223-3中SmaⅠ和HindIII酶切位点间，其质粒图谱见图1。 

本发明还提供一种重组质粒pKTR-E，其由以下方法制备： 

以重组质粒pKR-E为模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的下游引物扩增，BamHI/SphI双酶切扩增产物，获得由Tac启动子、SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子、rrnB T1Terminator终止子、rrnB Terminator终止子组成的片段，然后与经过BamHI/SphI双酶切的质粒pKK223-3-ThrA’BC连接即得； 

其中，所述Tac启动子、rrnB T1Terminator终止子位于片段两端，SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子位于Tac启动子、rrnB Terminator终止子之间，rrnB Terminator终止子位于SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子和rrnB T1Terminator终止子之间。 

经PCR和酶切验证并测序，表明所述片段已成功构建至质粒pKK223-3-ThrA’BC中BamHI和SphI酶切位点间，其质粒图谱见图2。