[发明专利]聚阳离子脂质体/磷酸钙纳米粒给药载体的制备方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种基因药物载体的制备领域，尤其涉及聚阳离子脂质体包裹磷酸钙纳米粒制备的基因给药载体的方法，即聚阳离子脂质体/磷酸钙纳米粒给药载体的制备方法。

（二）背景技术

基因治疗为遗传性疾病、传染病和癌症等的治疗提供了良好的前景，而研制安全有效的基因传递系统将成为基因治疗成功的最重要因素之一。作为研究热点的非病毒载体，制备简单、携带基因大小不受限制以及体内应用无特异性免疫反应，具有良好的应用前景。其中阳离子脂质体和阳离子聚合物是研究最为广泛的两种非病毒载体，因为它们能够通过静电作用与基因形成复合物，使之更容易进入细胞，并保护其免受核酸酶的降解。脂质体介导基因进入细胞的研究已有约20年的历史，由于阳离子脂质体具有较高的转染效率，其在基因治疗的研究中应用更为普遍。但亦有文献报道，在提高阳离子脂质体转染活性的同时，其表面的正电荷导致相应的细胞毒性，限制了其在基因治疗中的应用。

磷酸钙作为基因转染的载体，因其工艺简单，生物兼容性和安全高，目前仍广泛应用于体外基因转染研究。但与大部分非病毒载体-基因复合物一样，磷酸钙主要通过静电作用与基因相结合，容易出现粒子的聚集沉淀，稳定性较差，从而导致细胞摄取降低，单独使用磷酸钙作为基因载体，其转染效率通常要低于脂质体载体。

（三）发明内容

本发明的目的是提供一种聚阳离子脂质体包裹磷酸钙纳米粒的基因给药载体的制备方法，采用改进的的共沉淀法或反相微乳制备磷酸钙纳米粒，提高磷酸钙纳米粒的稳定性，以两亲性化合物聚乙烯亚胺-胆固醇、磷脂和/或胆固醇作为脂质体膜材，采用脂质体与磷酸钙纳米粒共同孵育得到所述基因给药载体。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供两种聚阳离子脂质体/磷酸钙纳米粒给药载体的制备方法：

第一种聚阳离子脂质体/磷酸钙纳米粒给药载体的制备方法：所述方法为：（1）磷酸钙纳米粒溶液的制备：将表面活性剂A水溶液、基因水溶液和氯化钙水溶液混合制成混合液A1，然后将表面活性剂B水溶液、磷酸盐水溶液和柠檬酸钠水溶液混合制成混合液A2，最后在搅拌的条件下将混合液A2逐滴滴入混合液A1中，滴加完毕后，室温搅拌0.5~2h，获得混合液，即磷酸钙纳米粒溶液；所述氯化钙水溶液中钙离子与磷酸盐水溶液中磷酸根离子的物质的量之比为1：0.001～1，氯化钙水溶液中钙离子与基因水溶液中基因的质量比为1～100：1，所述氯化钙水溶液的浓度为5~500 mmol/L，表面活性剂A和表面活性剂B的总质量用量为最终磷酸钙纳米粒溶液体积的0.01～2%，柠檬酸钠水溶液中柠檬酸钠的总质量用量为最终磷酸钙纳米粒溶液体积的0.001%～1%；所述表面活性剂A为聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物（即泊洛沙姆）、十二烷基硫酸钠、聚山梨醇、聚乙二醇或聚乙二醇单硬脂酸酯中的一种或两种以上任意比例的混合，所述表面活性剂B和表面活性剂A为相同的表面活性剂；所述磷酸盐水溶液中磷酸盐为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二氨、二磷酸盐或三聚磷酸钠中的一种；所述基因包括用于基因治疗常见的质粒DNA、小分子干扰RNA、反义寡核苷酸等基因物质但不限于上述例子；（2）聚阳离子脂质体溶液的制备：将聚乙烯亚胺-胆固醇与磷脂和/或胆固醇用有机溶剂A溶解后，真空旋转蒸发至干去除有机溶剂A，获得脂质薄膜，在脂质薄膜中加入去离子水，水浴超声处理5～30min，然后再在冰浴、100～400W条件下利用超声波探头处理1～10min后，最后采用孔径0.1～0.8μm的滤膜处理，取滤液，获得聚阳离子脂质体溶液；所述聚乙烯亚胺-胆固醇中的聚乙烯亚胺分子量为600～50000Da；所述有机溶剂A为氯仿、二氯甲烷、乙醚、石油醚或乙醇中的一种或两种以上任意比例的混合物；所述磷脂为天然磷脂或合成磷脂；所述聚乙烯亚胺-胆固醇与磷脂的质量比为1：0.01～100，所述聚乙烯亚胺-胆固醇与胆固醇的质量比为1：0～10；（3）聚阳离子脂质体/磷酸钙纳米粒给药载体的制备：将步骤（1）制备的磷酸钙纳米粒溶液与步骤（2）制备的聚阳离子脂质体溶液分别用去离子水稀释后等体积混合，在室温孵育5～60min后，获得所述聚阳离子脂质体/磷酸钙纳米粒给药载体；所述聚阳离子脂质体溶液的质量用量以聚乙烯亚胺-胆固醇分子中氨基的物质的量计，所述磷酸钙纳米粒溶液的质量用量以原始加入的基因分子中磷酸根的物质的量计，所述氨基与所述磷酸根投料物质的量之比计算为0.01～1000：1，即最终给药载体中聚乙烯亚胺-胆固醇与基因的比例，按氮/磷比（N/P，聚乙烯亚胺-胆固醇分子中氨基的摩尔数与基因分子中磷酸根的摩尔数之比）。