[发明专利]具有用于定向交联和固定化的热点的生物活性蛋白

权利要求书

1.生物活性的突变蛋白，其包含对应天然蛋白的所有必需三级结构元件和至少一个表面暴露的非天然结构元件，其特征在于，所述非天然结构元件位于蛋白一级结构内并且形成表面暴露的肽环，所述肽环用于建立热点以允许定向蛋白固定化和折叠的蛋白三级结构的增强稳定性。

2.根据权利要求1所述的生物活性的突变蛋白，其中所述突变蛋白选自包括酶、抗体、受体、抗体片段、结合蛋白和合成肽的蛋白。

3.根据权利要求2所述的生物活性的突变蛋白，其中所述突变蛋白优选地是酶，更优选地是纤维素酶。

4.根据权利要求3所述的生物活性的突变蛋白，其中所述突变蛋白是内切葡聚糖酶。

5.根据权利要求4所述的生物活性的突变蛋白，其中内切葡聚糖酶酶是里氏木霉(trichoderma reesei)的提取物。

6.根据前述权利要求中任一项所述的生物活性的突变蛋白，其中所述插入的表面暴露的肽环包含至少5个且至多15个氨基酸。

7.根据前述权利要求中任一项所述的生物活性的突变蛋白，其中所述插入的表面暴露的肽环是包含经修饰的内切核酸酶基因的寡核苷酸序列的翻译后产物，所述内切核酸酶基因具有选自赖氨酸和甘氨酸的氨基酸序列的多个密码子。

8.根据权利要求7所述的生物活性的突变蛋白，其中所述插入的表面暴露的肽环包含交替的赖氨酸和甘氨酸氨基酸序列。

9.根据权利要求7所述的生物活性的突变蛋白，其中所述内切核酸酶基因包含与SEQ NO 1具有至少60％序列同一性的核酸序列。

10.根据权利要求7所述的生物活性的突变蛋白，其中所述插入的表面暴露的肽环被定义为KKGGKKKGGK。

11.根据前述权利要求中任一项所述的生物活性的突变蛋白，其中所述插入的表面暴露的肽环位于所述蛋白的活性中心的基本上180°的对侧上，在溶剂可接近的且柔性的现有环内。

12.根据权利要求11所述的生物活性的突变蛋白，其中所述插入的表面暴露的肽环位于距离活性中心残基的Cα约的第112个和第113个残基之间。

13.遗传工程改造权利要求1中描述的生物活性的突变蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：

(1)沿着靶蛋白基因的外显子区域限定位点，所述位点用于插入形成表面暴露的环的寡核苷酸，

(2)限定DNA引物的序列，所述序列包含由所述形成环的寡核苷酸桥连的重叠端部，所述引物被设计成经由所述重叠端部沿着所述选择的插入位点的区域杂交，

(3)化学合成DNA引物，所述DNA引物包含由所述形成环的寡核苷酸序列桥连的所述重叠端部，

(4)应用重叠PCR延伸，以制备含有所述形成环的寡核苷酸序列的突变基因，所述寡核苷酸序列位于靶蛋白基因的外显子的指定区域内，

(5)应用DNA分离以纯化所述突变基因，

(6)表达所述突变基因，和

(7)分离含有所述表面暴露的肽环的所述靶蛋白的突变体。

14.根据权利要求14所述的方法，其中所述寡核苷酸序列包含与SEQ NO 1 SEQ NO 1具有至少60％序列同一性的核酸序列。

15.寡核苷酸序列，其包含经修饰的内切葡聚糖酶基因的核苷酸序列，所述经修饰的内切葡聚糖酶基因具有选自赖氨酸和甘氨酸的氨基酸序列的多个密码子。

16.根据权利要求15所述的寡核苷酸，其中内切核酸酶基因包含交替的赖氨酸和甘氨酸氨基酸序列。

17.根据权利要求15所述的寡核苷酸，其中所述内切核酸酶基因选自里氏木霉(Trichoderma reesei)(QM9414)egl1基因。

18.根据权利要求15所述的寡核苷酸，其中所述内切葡聚糖酶基因由以下序列编码：在SEQ NO 1中描述的核酸序列，所述序列的反向补体，所述序列的补体，所述序列的反转，或与前述序列中任一个的核酸序列具有至少60％序列同一性的序列。