[发明专利]高通量单核苷酸多态性测定法

说明书

对相关申请的交叉引用

本申请要求2011年11月29日提交的美国临时申请61/564,464的权益，其通过提及明确并入本文。

引用电子提交的序列表

序列表的正式拷贝以2012年11月27日创建且具有2kb大小的名称为“69826USNP_SEQ_ID_ST25”的文件以ASCII格式化序列表经由EFS-Web电子提交，并且与说明书同时提交。此ASCII格式化文件中含有的序列表是说明书的一部分，并且通过提及完整并入本文。

发明背景

本公开内容关注由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法，用于检测向日葵(Helianthus annuus L)中AHASL1-A122(AT)T单核苷酸多态性。AHASL1-A122(AT)T等位基因赋予对咪唑啉酮除草剂的耐受性。检测方法可以用于AHASL1-A122(AT)T等位基因的育种渐渗，由此将除草剂耐受性赋予向日葵品系。本公开内容可适用于农业生物技术。

作物管理系统内的除草剂耐受性性状使用给种植者提供了更有效且有益的植物管理解决办法。采用除草剂耐受性性状的作物管理系统增加双期作(double-crop)和免耕(no-till)耕作制度的应用，改善杂草管理技术，降低能耗，并且一般而言相比于常规作物管理系统降低成本。一旦鉴定出某种除草剂耐受性性状，开发出能够用来可靠地检测该性状的方法对于该除草剂耐受性性状对作物的育种渐渗而言就是至关重要的。

已经鉴定出一种除草剂耐受性性状，其赋予对包括咪唑啉酮类在内的数类除草剂的耐受性，参见Kolkman等(2004)和WO2007/005581。在向日葵的第9号染色体内HaAHASL1编码序列的一个单核苷酸多态性(SNP)突变被定性为提供对咪唑啉酮除草剂的耐受性。不幸的是，由于与HaAHASL1享有高水平的序列相似性的侧向同源(paralogous)序列的存在，对HaAHASL1-A122(At)T特异性突变的高通量检测而变得困难。现有的用于检测HaAHASL1-A122(At)T突变的测定法，特别是基于凝胶电泳的测定法尤其是基于凝胶电泳的测定法，通量低，不方便，耗时，并且价格昂贵。期望的是通量高、划算、且效率高的基因分型测定法。

本文中描述了用于检测向日葵中的HaAHASL1-A122(At)T等位基因的单核苷酸多态性(SNP)测定法的开发。该测定法提供了用于分子标记辅助选择(MAS)的有效育种渐渗方法，以提供对向日葵品系的咪唑啉酮耐受性性状育种渐渗，由此显著提高育种选择效率。相对于其它定量PCR技术，该测定法可减少合成新测定法的成本和时间。此外，在业已尝试其他定量或检测技术失败的场合，本测定法可取得成功。

发明概述

本公开内容提供了由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法，用于检测HaAHASL1基因内的HaAHASL1-A122(At)T SNP的存在或不存在，所述方法包括：

从向日葵分离基因组DNA样品；

向该分离的基因组DNA样本加入一组寡核苷酸引物，其中该组寡核苷酸引物包含(are comprised of)：由SEQ ID NO:3组成的突变型等位基因检测共用引物、由SEQ ID NO:4组成的野生型等位基因检测共用引物、由SEQ ID NO:5组成的下游共用引物，和荧光标记的引物；

对所述分离的基因组DNA样品和该组寡核苷酸引物进行扩增过程；并

检测至少一种扩增产物，其中所述扩增产物指示HaAHASL1-A122(At)TSNP的存在或不存在。

公开内容的一个实施方案涉及一种方法，其中所述扩增产物由84个碱基对组成。

公开内容的另一个实施方案涉及一种方法，其中所述存在或不存在的SNP的位点位于向日葵的第9染色体的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5之间。

公开内容的另一个实施方案涉及一种方法，其中所述存在或不存在的SNP的位点位于向日葵的第9染色体的SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5之间。

公开内容的另一个实施方案涉及使用所述由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法鉴定不同植物品系中HaAHASL1-A122(At)TSNP的存在或不存在。因此，本公开内容的另一个实施方案由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法，其可以用于鉴定含有HaAHASL1-A122(At)T SNP的植物品系。