[发明专利]蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌

说明书

本发明涉及其中通过遗传修饰使超过一种分泌的蛋白酶失活的炭疽芽胞杆菌。这类蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌相比于其他细菌，特别是其他芽孢杆菌具有改进的产生重组分泌蛋白质的能力。改进包括经常以高产率产生完整的(即成熟的全长)蛋白质。本公开提供一种炭疽芽孢杆菌，其包含使金属蛋白酶M4家族的蛋白酶失活的遗传修饰和使金属蛋白酶M6家族的蛋白酶失活的遗传修饰。还提供用编码产物的重组分子转化的、包含这类遗传修饰的经修饰炭疽芽孢杆菌，以及制备和使用这类炭疽芽孢杆菌的方法。

发明领域

本发明涉及一种蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)及其作为生产微生物产生稳定的(即完整的)蛋白质，包括重组分泌的蛋白质的用途。

发明背景

芽孢杆菌的种如炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，就其快速生长速率、高产率和将产生的产物直接分泌到培养基中的能力而言是用于重组蛋白质生产的有吸引力的微生物。炭疽芽孢杆菌就其产生炭疽毒素的能力和正确折叠蛋白质的能力而言也是有吸引力的。然而，考虑到该微生物分泌到培养基中的大量胞外蛋白酶(导致蛋白质降解)和它们形成孢子的事实，芽孢杆菌的吸引力下降。

在生长于认为模拟在感染的动物宿主中的那些条件下时，革兰氏阳性细菌病原体炭疽芽孢杆菌(本文中亦称为炭疽芽孢杆菌)分泌高水平的3种蛋白质，其统称为炭疽毒素：保护性抗原(PA)、水肿因子(EF)和致死因子(LF)。PA是受体结合组分，其作用于向真核细胞的胞质溶胶投递LF和EF；EF是钙调蛋白依赖性腺苷酸环化酶，而LF是锌金属蛋白酶，其切割促细胞分裂剂活化的蛋白质激酶激酶家族的大多数成员；参见例如，Leppla SH等,2000,inAnthrax toxin,bacterial protein toxins,445-472,Aktories K等,(编),Springer,Berlin；Moayeri M等,2011,Anthrax toxins,Bacillus anthracis and Anthrax,121-156,Bergman(编),John Wiley&Sons,Inc.,Hoboken,NJ；Moayeri M等,2009,Mol.AspectsMed.30,439-455；Young JA等,2007,Annu.Rev.Biochem.76,243-265。PA、EF和LF在病毒性质粒pXO1上分别由pag、cya和lef编码。病毒性质粒pXO2编码荚膜(capsule)形成和解聚所需的蛋白质。缺少一种或两种病毒性质粒的炭疽芽孢杆菌通常在大多数动物宿主中消弱。单一的PA、EF和LF组分是无毒性的；一种PA与至少两种EF、至少两种LF、或EF和LF的混合物的组合是毒性所需要的。

由于炭疽致病机制高度依赖于炭疽毒素蛋白的作用，因此疫苗和治疗物开发努力聚焦于抵消毒素作用，通常通过生成对PA的抗体。目前在美国许可的且几乎50年前开发的炭疽疫苗(参见例如，Puziss M等,1963,J.Bacteriol.85,230-236)由蛋白酶缺陷性炭疽芽孢杆菌菌株(V770-NP1-R)的部分纯化的培养上清液组成。PA是该疫苗中最丰富的蛋白质和关键的免疫原。通过确立方法的规模扩大从炭疽芽孢杆菌产生重组PA疫苗的努力(参见例如，Farchaus JW等,1998,Appl.Environ.Microbiol.64,982-991)似乎受到终产物不稳定性的妨碍。

尽管可将毒素组分作为重组蛋白从炭疽芽孢杆菌培养上清液纯化(参见例如，Farchaus JW等，同上；Varughese M等,1999,Infect.Immun.67,1860-1865；Singh Y等,1991,J.Biol.Chem.266,15493-15497；Park S等,2000,Protein Expr.Purif.18,293-302)，但完整性和产率均受到共分泌的炭疽芽孢杆菌蛋白水解酶的限制。