[发明专利]代谢进化方法

权利要求书

1.一种代谢途径中天然芳族小分子产物变体的代谢进化方法，其通过采用至少一种基因A的基因嵌合体来体细胞体内组装和重组所述代谢途径来进化，所述方法包括：

a)在单个步骤过程中，

(i)用与作为细胞基因组的整合部分或存在于基因构建体框架中的待重组的另一基因的序列同源性小于99.5%的至少一种基因A转化细胞，

(ii)重组所述基因，

(iii)在靶基因组的整合位点产生所述基因的基因嵌合体，其中所述至少一种基因A在与所述整合位点的5′或3′端锚定的5’端或3’端具有单侧翼靶序列，

(iv)重组所述代谢途径的最终的其它基因，和

b)选择能够表达所述变体的包括所述基因嵌合体和所述最终的其它基因的克隆。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述另一基因为所述细胞基因组的一部分。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中用至少一种基因A和至少一种基因B共转化所述细胞，其中所述基因A的单侧翼靶序列锚定至所述靶基因组整合位点的5′端，并且其中所述基因B连接至锚定于所述整合位点3’端的单侧翼靶序列。

4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中用至少两种不同基因A1和A2共转化所述细胞，和可选地用至少两种不同基因B1和B2共转化。

5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中共转化至少一种其它基因C，所述其它基因C具有与所述基因A和/或所述另一基因的序列杂交的序列，从而获得所述其它基因C与所述基因A和/或所述另一基因的组装。

6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述基因A和/或所述另一基因为非编码序列或编码多肽或具有活性的部分多肽的序列。

7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中将所述代谢途径的至少两种基因重组和组装。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述基因为优选300至20,000bp的线性多核苷酸。

9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中获得至少3多至20,000个碱基对的优选每700bp具有至少3个交叉事件的基因嵌合体。

10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其中所述细胞为DNA修复缺陷型细胞。

11.根据权利要求1至10任一项所述的方法，其中所述细胞为真核细胞或原核细胞，所述真核细胞优选真菌、哺乳动物或植物细胞。

12.根据权利要求1至11任一项所述的方法，其中所述天然芳族小分子选自由苯丙素类、类黄酮、黄酮醇、花青苷、木质素、花青素、查耳酮、香草醛和其天然产生的衍生物组成的组。

13.根据权利要求1至12任一项所述的方法，其中所述变体由重组酶变体合成。

14.一种产生代谢途径中天然芳族小分子产物的变体的细胞文库的制备方法，其包括通过采用至少一种基因A的基因嵌合体来体细胞体内组装和重组所述代谢途径，从而工程化重组细胞，所述方法包括：

a)在单个步骤过程中，

(i)用与作为细胞基因组的整合部分或存在于基因构建体的框架中的待重组的另一基因的序列同源性小于99.5%的至少一种基因A转化细胞，

(ii)重组所述基因，

(iii)在靶基因组的整合位点产生所述基因的基因嵌合体，其中所述至少一种基因A在与所述整合位点的5′或3′端锚定的5’端或3’端具有单侧翼靶序列，

(iv)重组所述代谢途径的最终的其它基因，和

b)收集包括所述基因嵌合体和所述最终的其它基因的克隆从而获得能够产生所述变体的文库。

15.根据权利要求14所述的方法获得的文库，其包括至少10E3种产生所述变体的不同克隆。

16.根据权利要求15所述的文库，其为包含编码一系列代谢途径的重组基因的细胞文库。

17.根据权利要求15或16所述的文库，其为包括编码一系列合成酶的重组基因的细胞文库。

18.一种合成重组酶的文库，其可由根据权利要求15至17任一项所述的文库获得。

19.一种生物体，其包括来自根据权利要求15至18任一项所述的文库的基因变体。