[发明专利]抗神经生长因子抗体及其制备和使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及充当犬神经生长因子的拮抗剂抗体及其片段。本发明还涉及制备这些抗体的方法以及这些抗体和片段在治疗犬的与神经生长因子相关的病症中的治疗用途，例如疼痛、疼痛相关病症以及与导致慢性疼痛发作的病症。

背景技术

神经生长因子（NGF）是天然存在的分泌蛋白，其由α多肽链、β多肽链和γ多肽链构成。NGF是神经营养因子家族的成员，其参与许多不同的作用。NGF促进感觉神经元和交感神经元的生存和分化，并且通过两类膜结合受体即低亲和性NGF受体p75和高亲和性NGF受体跨膜酪氨酸激酶TrkA来传达信号。NGF与TrkA或p75的结合导致感觉神经元中神经肽的上调。

已经描述了使用NGF拮抗剂治疗人类的疼痛和疼痛敏感(Cattaneo A.、Curr.Op.Mol.Ther.201012(1):94-106)。例如，国际专利申请WO2006/131951描述了人源化形式的大鼠αD11(aD11)单克隆抗体。αD11抗体对小鼠NGF具有结合特异性，但已知也与人类和大鼠形式的NGF结合。在施用至人之前，需要对αD11大鼠衍生单克隆抗体进行人源化，从而使产生的中和抗体最少，该中和抗体是由人类对啮齿类衍生抗体的抗大鼠抗体(HAMA)反应产生的。而且，用人恒定结构域取代小鼠恒定结构域允许选择下游效应子功能。

目前，通过施用数种镇痛剂包括局部和全身麻醉剂、麻醉性镇痛剂、α2拮抗剂、非类固醇抗炎药(NSAIDs)和类固醇来进行犬的疼痛管理。这些药物中的每一种都需要频繁地施用并且在功效和安全性方面也有局限性。因此，对于患有慢性疼痛例如患有癌痛或关节炎的犬，需要不频繁施用且持久有效的疼痛缓解。

虽然NGF在犬组织中表达，并且已经表征了犬NGF分子(Eisele I.Wood IS.German AJ.Hunter L.Trayhurn P.”Adipokine gene expression in dog adipose tissues and dog white adipocytes differentiated in primary culture”Hormone&Metabolic Research.37(8):474-81、2005Genbank XP_540250)，但该文章既没有描述犬NGF的拮抗剂，也没有在犬中使用阻塞NGF介导的信号传导以防止或缓解疼痛。由于中和抗体的产生，因此在犬中使用在其他物种中充当抗NGF拮抗剂的已知抗体并不可行。而且，包含犬衍生恒定结构域和衍生自已知的抗NGF抗体例如αD11的可变结构域的嵌合抗体的产生，并不能保证与犬NGF结合。此外，这样的抗体可以显示出与犬中可能存在但最初衍生该抗体的物种中不存在的其他靶表位的交叉反应。另外，中和抗体的产生将限制该抗体的长期治疗施用，当治疗与慢性疼痛相关的病症或癌病症况时，这是特别重要的条件。同样，使用CDR移植或相关的技术产生犬源化形式的抗NGF抗体可能导致中和抗体的产生，并且可能进一步显示抗原结合亲和性与亲合力的降低。因此，迫切需要用于犬疼痛治疗中充当犬NGF拮抗剂的结合成员(binding member)，其中该结合成员保持高水平的结合亲和性与亲合力，同时避免了针对其的中和抗体的产生。

发明概述

经过大量的努力，本发明人意外地发现了一种制备抗体的方法，该抗体产生特异性结合犬NGF且中和犬NGF生物活性的非免疫原性抗体及其结合片段。特别是，出乎意料地，本文表明，本发明的抗体及其结合片段与犬NGF的结合，通过抑制犬NGF与高亲和性TrkA受体或与p75受体的结合，隔绝了犬NGF的生物活性。这反过来阻止了感知神经元中神经肽的上调，结果减轻或消除了痛觉。使用重组DNA方法生产抗体，并且出乎意料地该抗体是非免疫原性的，也就是说，在施用至犬个体之后，针对该抗体的中和抗体并未产生。由于使用标准方法例如CDR移植等并未产生抗体，因此这样的发现是令人惊讶且完全出乎意料的。

根据本发明的第一方面，提供了制备适用于犬中的抗体的方法，其包括或基本上由以下步骤组成：

从犬之外的物种提供供体抗体，其中所述供体抗体对犬中存在的靶抗原有结合特异性；

将所述供体抗体框架区氨基酸序列的每一氨基酸残基与一个或多个犬抗体的框架区的氨基酸序列中对应位置的每一氨基酸残基比较，以鉴别出所述供体受体框架区氨基酸序列内与所述一个或多个犬抗体的框架区的氨基酸序列的对应位置的一个或多个氨基酸残基不同的一个或多个氨基酸残基；以及