[发明专利]在发酵期间用于酶促生产醇酯的脂肪酶的原位表达

权利要求书

1.方法，包括：

a)提供发酵培养基，所述发酵培养基包含来源于生物质原料的可发酵碳底物、产自来源于生物质原料的可发酵碳底物的醇和醇生产酵母微生物，其中所述醇生产微生物包含编码具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸，并且所述微生物表达并展示或分泌所述多肽，使得所述发酵培养基中存在所述脂肪酶活性；

b)使所述发酵培养基与羧酸接触；

其中所述脂肪酶活性以在细胞外将由所述微生物产生的醇的至少一部分转化成醇酯的足够量存在于所述发酵培养基中。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括使所述发酵培养基与提取剂接触以形成包括水相和有机相的两相混合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述提取剂包括所述羧酸。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述产物醇是C₂-C₈烷基醇。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述产物醇是乙醇。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述醇酯包括脂肪酸乙酯。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述产物醇是丁醇。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述醇酯包括脂肪酸丁酯。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述醇酯还包括脂肪酸乙酯。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽在所述酵母微生物的表面上展示。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽包含与SEQ ID NO：249、250、251、252、253或它们的片段中的任何一个具有至少约70％同一性的序列。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸包含与具有SEQ ID NO：1、3、5、7、8、9、46、48、50、52、54、255、271或273的多核苷酸具有至少约70％同一性的序列。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽包含与具有SEQ ID NO：2、4、6、256、47、49、51、53、55、241、242、243、244、245、246、247、248、272、或274或它们的活性片段的多肽具有至少约70％同一性的序列。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽不包含糖基化基序。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽是没有糖基化的。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述羧酸包括游离脂肪酸，所述游离脂肪酸来源于玉米油、低芥酸菜子油、棕榈油、亚麻籽油、麻风树油、或大豆油。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述羧酸来源于与所述可发酵碳底物相同的生物质原料。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述羧酸包括具有C₁₂-C₂₂直链或支化的脂肪链的羧酸。

19.根据权利要求2-18中任一项所述的方法，其中所述与提取剂的接触和所述与羧酸的接触同时发生。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中由所述微生物产生的醇的至少约60％有效滴度被转化成醇酯。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基还包含甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的组合，并且其中所述脂肪酶活性使所述甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的组合的至少一部分水解以形成游离脂肪酸。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述在发酵期间产生的醇的有效滴度大于由不包含编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸的醇生产微生物在发酵期间产生的醇的有效滴度，并且所述微生物表达并分泌或展示所述多肽，使得所述发酵培养基中存在所述脂肪酶活性。