[发明专利]含有唾液酸的糖链的制造方法

说明书

技术领域

本发明涉及可应用于糖蛋白等药物、分析仪器用的标准品、学术用试剂、糖链阵列等的糖链的合成法。

背景技术

先前的大量研究表明连接于蛋白质的糖链结构在该蛋白质的生物活性的机能上扮演着重要角色。并且，糖链也称为“细胞的脸”。已知在细胞表面上表达的糖链与细胞间相互作用或信号传递、发育或分化、受精、癌转移等相关。关于哺乳类的糖链修饰，为人熟知的主要是Asn连接型、黏蛋白型、蛋白多糖型糖基化和其它的类型。这些修饰通过不同的生物合成途径，形成它们各自固有的糖链结构。已知的是在这样的糖链结构的非还原末端侧，加成海藻糖或唾液酸等糖。

唾液酸是对作为连接有氨基或羧基的特殊的9碳糖的神经氨酸中氨基或羟基被取代的化合物的总称。5位的氨基被乙酰化的N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）可能是自然界中最多的形式。另外，还已知有5位的氨基是以乙醇酰基修饰的N-乙醇酰基神经氨酸或去氨基神经氨酸KDN等各种结构。

据报道，含有唾液酸的糖链不仅存在于人类或老鼠等哺乳类中，还存在于脊椎动物或棘皮动物，甚至原生生物或具有革兰氏阴性病原性的一些细菌中。通过唾液酸转移酶制备该含有唾液酸的糖链。唾液酸转移酶用加成于胞苷一磷酸（CMP）的唾液酸作为底物供体，通过存在于唾液酸供体的2位的醛基，将唾液酸转移至例如半乳糖的3位或6位、N-乙酰半乳糖胺的6位、或另一唾液酸的8位等。例如转移唾液酸于半乳糖的3位的酶被称为α-2,3-唾液酸转移酶，转移唾液酸于半乳糖或N-乙酰半乳糖胺的6位的酶被称为α-2,6-唾液酸转移酶，转移唾液酸于另一唾液酸的8位的酶被称为α-2,8-聚唾液酸转移酶。其中，关于α-2,6-唾液酸转移酶，已知人类中作为转移唾液酸于半乳糖的6位的酶，有ST6Gal-I和ST6Gal-II，及作为转移唾液酸于N-乙酰半乳糖胺的6位的酶，有ST6GalNAc-I、ST6GalNAc-II、ST6GalNAc-III和ST6GalNAc-IV。

ST6Gal-I将作为具有连接于4位的半乳糖的N-乙酰葡糖胺的N-乙酰乳糖胺结构（Galβ1-4G1cNAc）识别为底物受体，从而修饰一些糖脂质或N-连接型糖链的非还原末端结构。其对底物受体的特异性主要是利用2分支或3分支的N-连接型糖链进行分析。据报道，唾液酸容易转移于α1,3连接的甘露糖的分支上的乳糖胺（参考非专利文献1）。关于2分支或3分支的N-连接型糖链的制备，因为例如难以从天然物中提取糖基转移酶的底物，和酶的大规模制备法尚未确立等，所以很难有效率地大量地生产这些糖链。

另一方面，关于4分支之N-连接型糖链的α2,6唾液酸转移反应，已通过使用来自牛的ST6Gal-I来进行研究。在糖链的4个N-乙酰乳糖胺结构中，唾液酸最容易转移至在α1,3连接的甘露糖上以β1,2连接加成的N-乙酰乳糖胺结构上，然后是在α1,3连接的甘露糖上以β1,4连接加成的N-乙酰乳糖胺结构，进一步的是在α1,6连接的甘露糖上加成的2个N-乙酰乳糖胺结构中任一者，但未发现含有四分子唾液酸的产物（参考非专利文献2）。另外，人ST6Gal-I，以及ST6Gal-Ⅱ已被报道具有底物特异性（参考非专利文献3和4。）。但对于以4分支的N-连接型糖链为受体底物的唾液酸加成还未进行研究。

据报道，有关ST6Gal-I的因CMP的产物抑制，其被0.25mM的CMP抑制49％（参考非专利文献5），或抑制71％（参考非专利文献6）。

另一方面，作为来自细菌的α2,6-唾液酸转移酶，报道有Photobacterium damsela JT0160（参考非专利文献7）、Photobacterium leiognathi JT-SHIZ-145（参考非专利文献8）等，但关于以4分支的N-连接型糖链为受体底物的唾液酸的加成，它们中的任一种均未被研究。

另外，关于4分支的N-连接型糖链的α2,3唾液酸转移反应，将其中四分子的唾液酸以α2,3连接加成的4分支N-连接型糖链加成于红细胞生成素（EPO）等糖蛋白（参考非专利文献9），据报道，唾液酸加成对糖蛋白在血中的稳定性有贡献（参考非专利文献10）。虽然这些结构为天然中存在的结构，但未见有实际上大量制备四分子的唾液酸以α2,3连接加成的4分支的N-连接型糖链的报告例。这是因为，就成本而言，用作原料的EPO等很难进行大量的制备，并且在酶合成中，也很难由其他天然物廉价地制备成作为受体的去唾液酸4分支型N-连接型糖链。并且，已知的是在EPO中也混合存在加成于糖蛋白的α2,3连接及α2,6连接的4分支型N-连接型糖链等（参考非专利文献11）。