[发明专利]一种肝素活性的测定方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药检测技术领域，具体涉及一种肝素活性的测定方法。

背景技术

肝素是由二种多糖交替连接而成的多聚体，无论在体内还是体外，均具有很强的抗凝作用，临床上把它作为抗凝剂药物而广泛使用，主要用于血栓性疾病的治疗及心血管手术、血液透析、体外循环等过程的抗凝处理。

肝素作为药物，其活性功能的精准检测无论对于生产过程的质量控制还是临床治疗中患者的动态监控均具有重要的意义。作为生物活性物质，其检测不能单单用化学或物理的方法，必须与生物检测法结合，目前肝素的活性测定多采用凝固法和发色底物法。

欧洲药典第7版（European Pharmacopoeia 7.0，EP7.0）采用凝固法测定肝素，该法的基本原理是观察在一定条件下待测样品与标准品对枸橼酸钠抗凝羊血浆与高岭土和脑磷脂混合、重钙化后的抗凝作用（凝固时间），来判断待测样品的肝素活性含量。中国药典（2010版）（三版）同样采用凝固法测定肝素活性，利用硫酸鱼精蛋白能中和肝素，进而影响反应体系中血浆凝固时间，通过凝固时间及中和的硫酸鱼精蛋白量来推算肝素活性。凝固法操作繁琐，耗时费力，尤其是中国药典所采用的方法，最终活性通过两个变量因素间接获得，精准性很差。相对于凝固法，发色底物法具有灵敏度高，操作简便的特点。美国药典第32版（United States Pharmacopeia 32，USP32）对肝素活性测定采用发色底物法，利用肝素-抗凝血酶复合物能够抑制活化的凝血因子Ⅹ水解发色底物的显色反应的基本原理，所述方法虽减少了检测时间，简化了操作程序，但由于其反应体系及时间的限制，需采用对数方程拟合标准曲线，进过对数方程的计算，检测结果与实际偏差较大，更不适于低活性肝素样品的检测。

发明内容

发明目的：本发明针对上述测定技术中存在问题，建立了一种具有较高精准性的肝素活性测定方法，试剂使用微量，操作简便。

技术方案：本发明所采用的技术方案为：

一种肝素活性的测定方法，其操作过程、反应体系及时间具体为：

1. 标准品与样品的处理

0.02mol/LTris缓冲液pH8.4梯度稀释肝素标准品，肝素活性浓度范围在0~0.1IU/ml之间；取4种或4种以上梯度活性浓度，制定标准曲线。样品如需稀释，同样用0.02mol/L Tris缓冲液（pH8.4）稀释至肝素活性浓度至0~0.1IU/ml。

Tris：是Tris(Hydroxymethyl)aminomethane的常用缩写；中文品名：三羟甲基氨基甲烷。

IU ：是International unit的常用缩写，是用生物活性来表示某些蛋白质、抗生素、激素、维生素及抗毒素量的药学单位。

IU/ml：是单位体积（ml）中所含的生物活性量。

2. 标准曲线制定及样品测定

（1）10~40μl等体积的已稀释标准品及样品加入微孔板不同孔中；

（2）每孔同时加入10~40μl等体积的1 IU/ml 抗凝血酶溶液，混合均匀，37℃孵育3分钟；

（3）每孔同时加入10~40μl等体积活化的牛凝血因子Ⅹ溶液，其浓度为10 nkat/ml，混合均匀，37℃孵育1.5分钟；

（4）每孔同时加入10~40μl等体积发色底物S-2765溶液，即N-α-苄氧羰基- D-精氨酰- L-甘氨酰-L-精氨酸-P-硝基苯胺的盐酸盐，N-α-Z-D-Arg-gly-Arg-pNA. HCl溶液，其浓度为2.5 mmol/L，混合均匀，37℃孵育3分钟；

（5）每孔同时加入10~40μl等体积50%（v/v）乙酸，混合均匀终止反应；

（6）10~40μl对应的测定溶液与4倍体积超纯水混合后作空白对照；

（7）微孔板直接在酶标仪上于405nm波长读取吸光值；

（8）根据肝素标准品梯度浓度与所对应吸光值，采用线性方程绘制标准曲线。

3. 样品肝素活性含量计算

依据标准曲线和样品反应物所对应的吸光值，计算肝素活性含量。

上述的一种肝素活性测定方法，其特征在于：所述的10～40μl标准曲线制定溶液及样品、10～40μl浓度为1 IU/ml 的抗凝血酶溶液、10～40μl浓度为10 nkat/ml活化的牛凝血因子Ⅹ溶液、10～40μl浓度为2.5 mmol/L发色底物S-2765、10～40μl 浓度为50%（v/v）乙酸和10～40μl对应的标准曲线制定溶液或待测样品，在同一次测定中所加的量（μl）相同。