[发明专利]一种简便的细菌基因敲除的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的是涉及一种简便的细菌基因敲除的方法。

背景技术

同源重组作为体内基因工程的新方法使DNA修饰变得更容易、更有效，它是功能基因组分析的高效方法，可以在没有限制性内切酶和DNA连接酶的情况下实现DNA修饰。

传统同源重组方法是利用RecA重组系统，但是以RecA同源重组为基础的基因敲除有很大的不足，如需要较长的靶基因同源臂，重组率很低，很难获得所需要的重组子等。1998年，Murphy首次报道了利用λ噬菌体Red重组系统在大肠杆菌染色体上进行基因替换的方法，将λ噬菌体的重组功能基因exo，bet，gam在多拷贝质粒上表达，用于野生型E.coli宿主菌的基因替换。近年来，Red重组以其较短的同源臂和较高的重组效率等优点广泛用于大肠杆菌的基因修饰中。Red同源重组由λ噬菌体的exo，bet，gam 3个基因组成，分别编码Exo、Beta、Gam 3种蛋白质。Exo作为双链核酸外切酶，可以结合在双链DNA.的末端，从5′向3′降解DNA单链，产生3′末端单链悬突(3′single strand DNA overhangs)。Beta作为单链退火蛋白，结合在由核酸外切酶(Exo)外切产生的3′末端单链悬突上，促进DNA互补链的退火。Gam蛋白作为Exo、Beta的辅助蛋白，可与RecBCD核酸外切酶结合，抑制RecBCD核酸外切酶活性，抑制体内的外源DNA的降解。RecBCD是高度ATP依赖的双链DNA核酸外切酶，在大肠杆菌中用于基因的同源重组和DNA复制叉的修复。研究表明，Gam蛋白对于反应进行中的RecBCD双链DNA核酸外切酶的抑制作用很小。事实上，Gam蛋白并不能抑制一个正在进行的反应，而是在ATP的存在下分离连在双链DNA末端的RecBCD。

对于敲除细菌基因的Red重组系统共需要三种质粒：一种质粒是表达重组酶相关的Exo、Beta、Gam这3种蛋白质的辅助质粒；另一种质粒含有两侧带有翻转酶结合位点(flipase recognition target，FRT)的抗性基因，用作PCR模板；最后一种质粒是抗性基因消除质粒，其含有的重组酶能特异识别FRT位点，从而消除染色体上同源重组的抗性基因。对于整个基因敲除过程中，最重要的是控制同源所需的三个蛋白的表达。表达这三个蛋白的质粒如pKD46、pRedET。这两个质粒均含有温度敏感型复制起始点oriR101，在37℃培养时能够正常复制，而高于37℃时会自动丢失。此外，pKD46上还含有ParaB启动子调控的exo、bet、gam基因，它们通过L-阿拉伯糖诱导表达，并携带氨苄青霉素抗性基因作为筛选标记。而pRedET上调控exo、bet、gam基因的表达的启动子则是P_BAD启动子；同样是通过L-阿拉伯糖诱导表达；但是P_BAD启动子比ParaB启动子的调控方式更严谨，P_BAD启动子同时还受araC基因产物的正调控和负调控，araC作为转录阻遏物可以与L-阿拉伯糖形成复合物，从而启动转录。

对于敲除细菌基因组中的靶基因目前常选用Red重组系统。不同的质粒上λ噬菌体的重组功能基因exo，bet，gam的表达调控方式不一样。对于选用由L-阿拉伯糖诱导重组功能蛋白表达的质粒，敲除不同基因则需要摸索L-阿拉伯糖的诱导浓度，此过程耗时耗力。

发明内容

基于此，本发明提供一种简便的细菌基因敲除的方法。

实现上述目的的技术方案如下。

一种细菌基因敲除的方法，包括以下步骤：(1)pSIM19转化E.coli O56得到含pSIM19的重组E.coli O56；

(3)制备含pSIM19的E.coli O56电感受态细胞：挑取重组E.coli O56的阳性克隆，培养，菌体浓度OD₆₀₀为0.4-0.5时放入42℃水浴摇床中，震荡摇匀后置于冰上冷却后，离心后，用预冷的无菌三蒸水悬浮菌体，分装至2-3管预冷的无菌的EP管中；然后用预冷的无菌超纯水水洗EP管中菌体四次，最后每管加入无菌水，制备到电感受态细胞E.coli O56/pSIM19；