[发明专利]一种简便的细菌基因敲除的方法

权利要求书

1.一种细菌基因敲除的方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)pSIM19转化E.coliO56，得到含pSIM19的重组E.coliO56；

(2)制备含pSIM19的E.coliO56电感受态细胞：挑取重组E.coli O56的阳性克隆，培养，菌体浓度OD₆₀₀为0.4-0.5时放入42℃水浴摇床中，震荡摇匀后置于冰上冷却后，离心后，用预冷的无菌三蒸水悬浮菌体，分装至2-3管预冷的无菌的EP管中；然后用预冷的无菌超纯水水洗EP管中菌体三至五次，最后每管加入无菌水，制备到电感受态细胞E.coliO56/pSIM19；

(3)以质粒pKD4为模版，PCR扩增带有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段，向电感受态细胞重组菌E.coli O56/pSIM19中加入所述带有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段；高压电击完成后立即加入SOC液体培养基，37±0.5℃，培养1.5±0.2h后，离心后倒掉部分上清，取适量菌体悬浮液涂布含50±2g/mL的卡那霉素的抗性平板，培养，长出单菌落，将单菌落划线于含50±2g/mL的卡那霉素的抗性平板中，长出较浓菌苔，筛选得到目的基因已经被消除的阳性重组子。

2.根据权利要求1所述的细菌基因敲除的方法，其特征是，所述pSIM19转化E.coli O56的步骤为：将质粒加入到E.coliO56感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴；42℃水浴热激90±2s，迅速转移至冰上，继续冰浴2±1min；无菌条件下，加入LB培养基，37±0.5℃，100±10rpm慢摇，恢复培养1±0.2h；离心培养物后取适量培养物涂布含100±2g/mL Amp的固体LB琼脂平板上，待液体被固体培养基吸收后，将平板倒置，37±0.5℃恒温培养，12-16h，得到含pSIM19的重组E.coliO 56。

3.根据权利要求1所述的细菌基因敲除的方法，其特征是，步骤(2)中用预冷的无菌超纯水水洗EP管中菌体时，每次在12000±20rpm，4±1℃的条件下离心1±0.1min以除去超纯水。

4.根据权利要求1-3任一项所述的细菌基因敲除的方法，其特征是，所述无菌超纯水是MiliQ超纯水。

5.根据权利要求1-3任一项所述的细菌基因敲除的方法，其特征是，步骤(3)中PCR扩增带有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段的扩增引物为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2。

6.根据权利要求1-5任一项所述的细菌基因敲除的方法所制备得到的目的基因wfaQ被敲除的阳性重组子E.coliO56。