[发明专利]SYBR Green 荧光染料DNA定量检测方法和试剂盒

说明书

技术领域：

本发明涉及一种检测基因组DNA和质粒DNA的方法和检测试剂盒，特别是涉及一种SYBR Green I荧光染料DNA定量检测试剂盒。 

背景技术：

在分子生物学领域进行DNA分析时常常需要对基因组DNA和质粒DNA进行准确定量。 

采用PicoGreen荧光染料法对核酸进行定量，因其方法的灵敏度高、线性范围广，因此应用非常广。然而，PicoGreen荧光染料价格昂贵，且在对DNA进行定量时的局限性表现在方法的准确度高低取决于试剂盒中DNA标准品含量的准确度，而目前市售的试剂盒中DNA标准品的含量值均为厂家提供的一个参考值，这个值一般是通过紫外吸收（OD260）确定的，没有相关的不确定度信息和溯源性。其次，由于PicoGreen对不同分子大小的DNA结合效率会有差异，如果依据定量的DNA标准和所测定的DNA样本分子大小差异很大时，会导致对样本定量结果的偏差很大，而目前商业化的试剂盒中均只有一个分子大小的Lambda DNA标准。有报道称：以Lambda为标准，如果对分子量<23kb的DNA进行定量，测定结果会比真实结果偏低。因此，如果对质粒DNA采用PicoGreen法定量，由于质粒DNA标准品的缺乏，现有的商业化的试剂盒还无法满足要求。 

SYBR Green I荧光染料的与PicoGreen相比价格低。经我们的研究发现SYBR Green I对双链DNA结合具有很好的效率，而结合单链DNA效率很低。目前，SYBR Green I荧光染料法普遍用于定量PCR扩增过程中与DNA结合或者通过染胶进行定量，还没有SYBR Green I直接与质粒DNA或基因组DNA结合进行定量的方法与试剂盒。研制SYBRGreen I对DNA定量的试剂盒，需要具有准确量值的DNA标准物质，目前并没有含有准确量值的DNA标准可用作SYBR Green I法定量质粒的标准。由于该量值直接关系到试剂盒定量方法的准确度高低。基于单分子扩增的数字PCR方法可对DNA进行绝对定量，从而为SYBR Green I荧光染料法提供DNA标准。 

发明内容：

本发明的目的是提供一种DNA荧光染料定量检测方法和检测试剂盒，该方法灵敏度高，线性范围广，准确度高，精密度好。 

为达到上述发明目的，本发明人进行了如下研究工作： 

1、SYBR Green I荧光染料对不同分子大小的DNA定量的线性关系 

选择了分子大小分别为5k，9k，48k的质粒/基因组分子作为研究对象，将DNA进行梯度稀释，稀释后的DNA与PicoGreen荧光染料结合后，测定荧光信号； 

结果发现：荧光信号不仅与DNA浓度成正比（相关系数>0.99），还与DNA分子大小相关，即分子量越大，线性相关曲线的斜率越大。 

2、SYBR Green I荧光染料法对质粒DNA定量的线性范围 

将质粒DNA稀释至0.01ng/mL～10000ng/mL，与荧光染料结合后，测定荧光信号值； 

结果发现DNA浓度在0.05ng/mL～1000ng/mL之间时，荧光强度与DNA浓度成正比。因此，SYBR Green I对质粒DNA定量的线性范围为0.25ng/mL～1000ng/mL。 

3、SYBR Green I荧光染料法对质粒DNA的检测灵敏度 

由于最低检测到的荧光信号对应的DNA浓度为0.01ng/mL，加样量100μL； 

因此计算出该方法的灵敏度为1pg。 

4、SYBR Green I荧光染料法对质粒DNA的定量限 

根据最低定量的线性范围，定量限为5pg。 

5、SYBR Green I荧光染料法对Lambda基因组DNA定量的线性范围 

将基因组DNA稀释至0.001ng/mL～10000ng/mL，与荧光染料结合后，测定荧光信号值，结果发现DNA浓度在0.01ng/mL～1000ng/mL之间时，荧光强度与DNA浓度成正比； 

因此，SYBR Green I对Lambda DNA定量的线性范围为0.01ng/mL～1000ng/mL。 

6、SYBR Green I荧光染料法对Lambda基因组DNA的检测灵敏度 

由于最低检测到的荧光信号对应的DNA浓度为0.005ng/mL，加样量100μL，因此计算出该方法的灵敏度为0.5pg。 

7、SYBR Green I荧光染料法对Lambda基因组DNA的定量限