[发明专利]在家蚕细胞内表达人源化糖蛋白转基因转座载体及构建法

说明书

技术领域

本发明涉及将piggyBac转座载体应用于生产转基因家蚕细胞系。具体地讲，本发明涉及构建一个用于生产转基因家蚕细胞系的新型piggyBac转座载体。该载体可用于构建转基因家蚕细胞系，并通过Bac-to-Bac 系统表达人源化糖蛋白。该载体包括一个GFP的报告基因和/或一个Neomycin的抗性筛选基因，以及1-4个糖基转移酶基因（GnT2, GalT, ST3, ST6）。

背景技术

piggyBac（以前叫作IFP2）转座子，是一个来源于鳞翅目昆虫的DNA型转座子，在结构上与Ⅱ型短的插入重复因子相关，在分类上属于第二类型，这一类型的因子包括hobo、hermers、mariner、P、Tcl和AC因子。piggyBac转座子最初是在杆状病毒（Baculovirus）侵染Trichoplusia ni昆虫TN-368细胞株系时，从Galleria mellonella（GmMNPV）或Autographa californica（AcMNPV）核多角体病毒内首次分离得到的。

piggyBac转座子是一个自主因子，长2476bp，含有一个RNA聚合酶Ⅱ启动子区和一个聚腺苷酸信号，该信号的侧面是一个可读编码框（ORF），编码1个单一的长约2.1kb的转录产物，即1个68kD的转座酶，该转座酶是转座子高频率的切出和转座所需的。piggyBac转座子的末端是长13bp的反向重复序列（ITR），其内侧各有一段间隔区（spacer），但并不对称（左端长3bp，右端长31bp），再靠内侧是各长19bp的对称的亚末端反向重复（STR）。piggyBac转座子反向重复序列的5’末端以2-3个C碱基结束，3’末端的G碱基在切出位点的选择过程中起作用。piggyBac转座子总是在TTAA目标位点处插入，因而被归纳为TTAA———特殊的可转移因子家族。

目前，piggyBac转座系统已成为在昆虫中使用最广的转座子，它已被证明能够在5个目(鳞翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目和直翅目)的20多种昆虫中转座。piggyBac转座主要用于昆虫的转基因研究，其携带的基因大多为可见的报告基因，如ZsGFP，DsRed1，EYFP等荧光标记。它们受位置影响比较小，可以很方便地测试转座效率。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可用于家蚕细胞内表达人源化糖蛋白的转基因新型转座载体及其制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明利用piggyBac转座系统，将一个GFP的报告基因和/或一个Neomycin的抗性筛选基因，以及4个人源化糖基转移酶基因（即GnT2、β4GalT、ST3和ST6），转座至家蚕细胞基因组上以获得一株新型的家蚕细胞系，并进一步利用Bac-to-Bac系统，在该新型细胞系内表达人源化的糖蛋白。

作为本发明的在家蚕细胞内表达人源化糖蛋白的转基因转座载体的一种改进：该载体中包含一个GFP报告基因以及以下4个糖基转移酶基因中的至少2个： GnT2、β4GalT、ST3和ST6。

该载体的构建方法为：将GFP报告基因以及以下4个糖基转移酶基因中的至少2个： GnT2、β4GalT、ST3和ST6分别通过酶切方式克隆进pXL-BacII 载体中。

作为本发明的在家蚕细胞内表达人源化糖蛋白的转基因转座载体的另一种改进：该载体包含一个Neomycin筛选基因以及以下4个糖基转移酶基因中的至少2个： GnT2、β4GalT、ST3和ST6。

该载体的构建方法为：将Neomycin筛选基因以及以下4个糖基转移酶基因中的至少2个： GnT2、β4GalT、ST3和ST6分别通过酶切方式克隆进pXL-BacII 载体中。

作为本发明建立转基因家蚕细胞系的另一种改进：将上述构建所得的两种载体与Helper质粒按按照3：3：1的质量比转染家蚕细胞，通过G418筛选，形成细胞单克隆化的克隆岛，再经传代培养，构成转基因家蚕细胞系。

综上所述，本发明的优点如下，构建新型的piggyBac转座载体，能应用于生产转基因家蚕细胞。该载体具有高效性和稳定性，并且具有一个GFP的报告基因或一个Neomycin的抗性筛选基因，便于检测和筛选。

备注说明：

GnT2 （beta-1,2-N-乙酰葡萄糖胺转移酶，beta-1,2-N-acetylglucosaminyltransferase），