[发明专利]一种棒状链霉菌的工程菌株及其制备方法与应用

说明书

本申请得到天津师范大学博士基金（52x09010）的资助。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种棒状链霉菌的紫外诱变及基因阻断突变菌及其制备方法。

背景技术

几十年来，由于抗生素的大量使用，导致了细菌对很多药物的抗药性，病原菌对β－内酰胺类抗生素的耐药性，己成为临床上难治性感染的重要因素之一。

克拉维酸（clavulanic acid）是棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）的代谢产物，又名棒酸，是第一个被发现并应用于临床的β-内酰胺酶抑制剂。克拉维酸本身的抗菌活性很弱，但它具有强力、广谱且不可逆的β-内酰胺酶抑制活性。克拉维酸与β-内酰胺类抗生素如阿莫西林(Amoxicillin)、替卡西林(Ticarcillin)分别联合，制成酶抑制剂联合制剂，可在不同程度上保护β-内酰胺类抗生素不被β-内酰胺酶灭活，从而提高该抗生素对产酶耐药菌的抗菌活性，提高临床疗效。

棒状链霉菌中头霉素C的合成代谢途径是以L-赖氨酸、L-半胱氨酸和缬氨酸为前体物质的。棒状链霉菌的lat基因编码赖氨酸ε-转氨酶（该酶是头霉素C合成途径中的关键酶），是牵涉到头霉素C合成的第一个基因，也是进行调控的首选基因。研究表明，棒状链霉菌中一种代谢产物的阻断可能导致其它代谢产物产量的提高。克拉维酸基因簇和头霉素C基因簇相邻，且受相同的调节蛋白CcaR的调控，Paradkar等（Paradkar AS, Mosher RH, Anders C (2001). Application of gene replacement technology to Streptomyces clavuligerus strain development for clavulanic acid production. Appl. Environ. Microbiol., 67(5): 2292-2297.）研究表明，在发酵过程中降低或消除棒状链霉菌中头霉素C的合成能够提高克拉维酸的产量，并可以有效减少发酵液中的干扰物质，简化提取工艺。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的棒状链霉菌克拉维酸产量低的不足，采用紫外诱变结合分子改造的方法对棒状链霉菌进行多方面改造，提供一种棒状链霉菌的高产工程菌株及其制备方法，该棒状链霉菌的突变菌株的克拉维酸产量得到较大提高。

本发明的一个目的在于克服上述技术问题，从而提供一种棒状链霉菌突变株棒状链霉菌突变株lat::Δ(Streptomyces clavuligerus lat::Δ) 菌株（保存的是最终产量最高的菌株）。

本发明所述的棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)较佳的是棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)NRRL3585。

本发明的另一个目的在于提供一种棒状链霉菌的紫外线诱变突变菌的方法。

本发明的还一个目的在于提供一种棒状链霉菌突变株lat::Δ(Streptomyces clavuligerus lat::Δ) 菌株在用于抗生素生产菌生产中的应用。所述的抗生素生产菌对象为产酶耐药菌。

棒状链霉菌突变株lat::Δ(Streptomyces clavuligerus lat::Δ) 菌株。该菌种是一种在获得的紫外诱变高产突变株为出发菌株的基础上，先将其lat基因的第191～1600位之间的核苷酸片段以一段安普抗性基因置换掉，再通过基因敲除技术去除安普抗性基因，获得不含有任何抗性标记的lat基因敲除的突变菌株。

菌落特征：成熟单菌落生长丰满，紧密，菌落呈草帽形。28℃培养3～5天后菌落表面生成暗灰绿色孢子，孢子成熟后易于刮下。

菌丝特征：气生菌丝为网状、白色，基内菌丝由浅黄到灰黄，都不产生可溶性色素。

根据本发明，所述的第安普抗性基因整合于本发明的棒状链霉菌的lat基因中。在lat基因中的整合位置是在基因组的任何位置，只要不影响菌株本身的生物合成，能够高产克拉维酸的情况，都在本发明的保护范围之内。

本发明更加详细的说明如下：

一、具体技术支撑

㈠  微生物名称和保藏情况

    棒状链霉菌lat::Δ菌株。该菌种在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：，保藏时间。