[发明专利]一种棒状链霉菌的工程菌株及其制备方法与应用

权利要求书

1.棒状链霉菌突变株lat::Δ(Streptomyces clavuligerus lat::Δ) 菌株 ，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No。

2.权利要求1所述的菌株，其中棒状链霉菌突变株lat::Δ(Streptomyces clavuligerus lat::Δ) 是由野生菌株Streptomyces clavuligerus NRRL3585突变而来，其是由所述野生菌株经紫外线诱变及基因工程改造筛选得到的克拉维酸高产的突变株。

3.权利要求1或2所述棒状链霉菌突变株lat::Δ(Streptomyces clavuligerus lat::Δ) 菌株在制备用于提高抑制耐药细菌产生β－内酰胺酶的活性增强抗生素广谱抗菌药物中的应用。

4.权利要求3所述的应用，其中所述的提高抑制耐药细菌产生β－内酰胺酶的活性指的是提高克拉维酸产量抑制β－内酰胺酶活性。

5.一种紫外线诱变选育高产棒状链霉菌突变株B372(Streptomyces clavuligerus B372) 菌株的方法，其特征在于包括如下步骤：

  （1）棒状链霉菌孢子悬液的制备；

  （2）紫外线诱变；

  （3）初筛:通过琼脂块法对高产克拉维酸的棒状链霉菌进行初筛；

  （4）复筛:用摇瓶发酵，HPLC法检测发酵液克拉维酸量的多少来进行复筛；

  （5）验证高产菌株:将复筛后得到的高产菌株传代培养6次，每次都用与复筛一样的方法对菌株产酸稳定性进行验证。

6.根据权利要求5所述的诱变育种方法，其特征在于：紫外照射诱变采用15W或30W紫外线，提前预热20—30分钟后，将孢子悬液置于距离紫外线20—30cm处进行紫外照射30—45秒。

7.根据权利要求5所述的诱变育种方法，其特征在于按以下的步骤进行:

（1）构建lat 基因中插入安普抗性框的重组质粒pELA；

（2）将含有lat基因的重组质粒pELA转化宿主细胞，获得转化子；

   （3）构建 lat基因内部被敲除的重组质粒pSCAR；

   （4）将棒状链霉菌B372作为受体，与步骤2)所述的转化子进行接合转移，获得接合子，即棒状链霉菌的lat基因阻断突变菌S.clavuligeruslat::aac；

（5）将棒状链霉菌S.clavuligeruslat::aac作为受体，将步骤3）所述的重组质粒pSCAR转入受体菌，获得不含有任何抗性标记的lat基因敲除的突变菌株S.clavuligeruslat::Δ。

8.根据权利要求7所述的诱变育种方法，其特征在于，所述的棒状链霉菌突变株B372的lat基因的第191～1600位之间的核苷酸片段被一段安普抗性基因置换掉，不含有任何抗性标记的lat基因敲除的突变菌株。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤（1）和（3）所述的重组载体的载体骨架是质粒大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pGH112；步骤（2)所述的宿主细胞是大肠杆菌ET12567。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤（5)所述的受体是棒状链霉菌lat::aac的原生质体，原生质体的制备条件为采用1mg/mL的溶菌酶浓度，酶解45min，原生质体的转化条件为采用25%的PEG1000介导转化，转化前将棒状链霉菌原生质体于45℃温育10min，以降低链霉菌的限制性酶的活性。