[发明专利]农杆菌介导转基因培养大岩桐植株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及大岩桐植株再生方法，尤其涉及农杆菌介导转基因培养大岩桐植株的方法。

背景技术

花卉作为鲜活观赏商品，在圣诞节、元旦、春节等重大节日之前需求量大，其价格在需求高峰、一般、停滞等不同时期相差高达7、8倍，常常形成供给高潮与需求高峰期的错位，导致很大的生产和流通风险。因此，运用现代基因工程技术培育有自主知识产权的目标花期花卉品种，不仅有利于保护花农的经济利益，更有利于提升我国花卉产业的高科技含量，跻身于世界花卉生产强国的行列。

大岩桐（Sinningia speciosa）原产巴西，为苦苣苔科多年生球根花卉，是一种极好的春夏季节室内盆花，世界各地广泛栽培。大岩桐外植体极易分化，在附加2.0 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA的MS培养基上可不经愈伤组织而在外植体边缘直接分化苗，生长也比较快速。

如中国发明专利（申请号：200410061427.9 申请日：2004-12-24），公开了一种大岩桐栽培方法，以组织培养的无根苗为材料，其步骤是，首先将大岩桐嫩梢切下；其次是将新梢插入基质中；第3是浇灌营养液；第4是将生根苗定植在相同的基质中。但是国内外对大岩桐的转基因研究一直未见报道。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种农杆菌介导转基因培养大岩桐植株的方法，该方法可以快速高效转化大岩桐，获得转化植株。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

农杆菌介导转基因培养大岩桐植株的方法，该方法采用大岩桐幼嫩叶片作为外植体，外植体预培后与去除培养物中残存的抗生素和细菌代谢物的农杆菌菌株EHA105菌液共培，脱菌，再经过抗性筛选后，直接分化获得转基因植株。

作为优选，上述的农杆菌菌株EHA105菌液的OD₆₀₀为0.2~0.4，共培的时间为2~4天。

作为优选，上述的共培的方法如下：取出预培养的叶片于无菌的小烧杯中，加入制备好的菌液中浸 3~8min，摇晃数次；取出叶片,在无菌滤纸上吸干多余的菌液, 叶背朝上置于基本 MS固体培养基上, 25℃，暗培养 2~4d。

作为优选，上述的农杆菌菌株EHA105菌液培养采用含有卡那霉素和利福平LB 液体培养基培养。

作为最优选，上述的农杆菌菌株EHA105菌液的制备方法如下：

1）从-70℃冰箱取出含有重组质粒的农杆菌菌株EHA105，在含有抗生素Kan 100 mg/L,Rif 80 mg/L的LB固体培养基上划线活化，直至培养基上长出农杆菌单菌落；

2）取 5～10ml LB 液体培养基, 加入抗生素-卡那霉素和利福平, 使其终浓度为 Kan 100mg/L, Rif 80mg/L ；从新鲜平板中挑取单菌落加入其中, 摇匀, 于 28℃, 180 r/min 过夜培养至对数期，OD₆₀₀约为0.8～1.0；

3）吸取上述菌液1ml于1.5ml离心管中，4℃，4000rpm离心2min，去上清，再用30ml 1/2 MS悬浮农杆菌，再摇约 1-2h，至菌液略显混浊，OD₆₀₀为0.2~0.4即可, 备用。

作为优选，上述的脱菌采用特美汀无菌溶液水洗。由于现有的羧苄青霉素和头孢霉素连续使用后，抗性愈伤组织分化频率较低，因此在本发明中选用特美汀（160 mg/L）除菌，这样既能取得除菌效果又不影响抗性组织的分化能力。

作为优选，上述的抗性筛选采用的标记基因是hpt，采用潮霉素作为选择压力。在大岩桐的转化中，现有的卡那霉素筛选会干扰绿色植株的再生，而绝大多数植物对潮霉素比对卡那霉素敏感，潮霉素用于植物转化比卡那霉素的效果好。故我们都是选用潮霉素作为抗性筛选标记。

作为优选，上述的潮霉素的浓度为20mg/L。

作为优选，上述的抗性筛选的抗性选择培养基为：MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.3 mg/L+hgy 20mg/L+Tm 160 mg/L；进行两轮选择培养，每轮持续12~15d。

作为优选，上述的外植体预培取大岩桐无菌苗的中、上部的叶片，沿叶缘剪一圈,接到含80~120 uM 乙酰丁香酮的基本MS固体培养基上，25℃，暗培养20~30h。

本发明由于采用了上述的技术方案，借助农杆菌介导法，可以快速高效转化大岩桐，获得转化植株首次成功获得大岩桐转基因植株，取得了较好的成果。

附图说明

图1转基因大岩桐的组培过程。