[发明专利]一种提高抗肝片吸虫病DNA疫苗免疫保护率的疫苗组合及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用提高Th2免疫反应从而提高编码肝片吸虫Cat L1（FhCat L1）DNA疫苗保护率的方法。具体涉及在构建编码肝片吸虫Cat L1（FhCat L1）DNA质粒的基础上，利用宿主机体Th2免疫反应对蠕虫感染具有很好的杀灭或抑制作用，选用能诱导树突状细胞（DC）成熟、增加DC数量和频率的Flt3L及能诱导宿主免疫反应趋向Th2的细胞因子IL4作为DNA疫苗的分子佐剂，提高FhCat L1 DNA疫苗在免疫BALB/c小鼠后的免疫原性和免疫保护率，为抗肝片吸虫DNA 疫苗的研发提供一种新思路。

背景技术

肝片吸虫是一种寄生性蠕虫，能引起牛、羊等反刍动物及人的严重吸虫病[1]。在世界范围内，肝片吸虫病直接影响着畜牧业的发展和人类健康，据估计每年可造成约20亿美元的经济损失[2]，是一种不可忽视的重要人畜共患寄生虫病。对此病的防治一般采用三氯苯咪唑等化学药物，但这些药物只对早期的未成熟虫体或成虫具有良好效果，对感染后期的治疗不佳。最近发现，家畜已对三氯苯咪唑等化学药物产生耐药性[3-5]。同时，人们对畜产品中化学药物残留量的要求也越来越严格，这给利用化学药物控制吸虫病带来极大困难。因此，防治吸虫病急切需要一种能替代化学药物的治疗方法， 这就给疫苗发展带来了良好契机[6]。

疫苗研究的关键是对病原引起的机体免疫规律的了解。肝片吸虫可引起Th1/Th2混合免疫反应，但根据此原理研究的疫苗效果却不是很理想[7，8]。作为蠕虫的一种，肝片吸虫应该具有其他蠕虫如丝虫或其他线虫的免疫特性，即可引起宿主以Th2为主的免疫反应[9-12]。因此，可假设能刺激机体产生Th2免疫反应的疫苗可提高抵抗肝片吸虫感染的能力。以此假设为前提，可通过将机体免疫反应调节趋向Th2反应，从而提高抗感染能力。因此，可考虑选用能调节机体免疫反应趋向Th2的细胞因子或趋化因子。研究表明，IL4就具有此种功能，这与其介导幼稚T细胞向CD4+T细胞分化产生Th2细胞因子如IL5，IL13，IL9和 IL4密切相关[13，14]。另外，理想的疫苗应能够刺激机体产生特异性的免疫反应，并能诱导长期持久的免疫记忆，以保护机体免受疾病侵袭。树突状细胞（DC），是已知体内最强的专职抗原提呈细胞，其最大的特点是能够刺激初始T细胞增殖和启动机体免疫反应。因此，选用能能诱导树突状细胞（DC）成熟，增加DC数量和频率的细胞因子或趋化因子作为疫苗佐剂，可大大提高DC呈递抗原的能力，从而提高疫苗的免疫保护率。Flt3L即是这样的趋化因子，它能与DC表面分子作用，提高抗原呈递能力[15，16]。

除此之外，优秀的疫苗候选因子也是疫苗研究的关键。事实上，到目前为止，有很多肝片吸虫的疫苗候选分子如谷胱甘肽S转移酶（GST）, 亮氨酸氨肽酶(LAP), 脂肪酸结合蛋白（FABP）及组织蛋白酶 L（Cat L）都被用于开发诸如重组蛋白疫苗及DNA疫苗，虽然 这些疫苗能在实验动物和大动物上产生一定的免疫保护[17，18]，但至今仍没有一种商品化疫苗能投入到临床生产，这在很大程度上受制于疫苗的保护率低下的现状，而这种现状与如何提高抗原的呈递有着密切的关系[19-22]。 

组织蛋白酶L是一种半胱氨酸蛋白酶，通常情况下这种酶以非活性状态存在于分泌囊泡的肠上皮细胞中[23，24]，当前体酶活化并被释放后， 寄生虫即可利用活化的组织蛋白酶行使多种重要的功能，如能在肝脏中将蛋白分解为多肽从而利于营养的吸收和降解基质蛋白从而有利于寄生虫从肠道迁移到肝脏[25，26]。研究还表明，组织蛋白酶L还在免疫逃避和免疫调节中发挥重要作用。它可分解宿主的免疫球蛋白从而破坏宿主的免疫攻击，并能介导和调节巨噬细胞的活性、抑制Th1免疫反应[27，29]。目前，对肝片吸虫组织蛋白酶L的疫苗开发主要集中在重组蛋白疫苗和DNA疫苗的研究上。有研究表明重组肝片吸虫组织蛋白酶L具有与天然蛋白相似的功能[30]，在荷斯坦牛身上免疫后获得了48.2%的减虫率和显著升高的总IgG [31]。DNA 疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因（DNA 或 RNA）直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。在DNA疫苗的研究中，大鼠罐胃免疫肝片吸虫组织蛋白酶L DNA疫苗并用囊蚴感染后，虽能获得70%的免疫保护[32]，但免疫途径操作。因此，如何提高肌肉注射DNA疫苗的保护率就成了目前DNA疫苗开发的热点。

发明内容