[发明专利]诱导天然四倍体泥鳅雌核发育的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多倍体鱼类雌核发育的方法，尤其是一种操作方法简单、快捷，无需卵子染色体加倍处理，可快速、高效生产雌核发育二倍体泥鳅的诱导天然四倍体泥鳅雌核发育的方法。

背景技术

人工诱导雌核发育(artificially induced gynogenesis)是通过物理或化学方法使遗传失活的精子激活卵，精子不参与合子核的形成，卵仅靠雌核发育形成胚胎并经过染色体加倍发育成正常个体的技术。到目前为止，国内外先后对斑马鱼(Danio rerio)、青鳉鱼(Oryzias latipes)、香鱼(Plecoglossus altivelis )、大麻哈鱼(Oncorhynchus rhodurus )、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、罗非鱼(Oreochromis niloticus)、非洲鲇鱼(Clarias gariepinus)、褐牙鲆(Paralichthys olivaceus) 、漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma) 、大黄鱼(Pseudosciaena crocea，现名 Larimichthys crocea) 、细鳞大麻哈鱼(Oncorhynchus gorbuscha) 等进行了雌核发育诱导。人工诱导雌核发育是一种实用性较强的科学手段，在产生纯系、染色体操作、遗传分析以及性别控制等方面都有潜在的应用价值。

目前，人工诱导鱼类雌核发育二倍体包括两个关键步骤：(1) 精子染色体的遗传失活；(2) 卵子染色体的二倍体化。前者主要用来激活卵子发育；后者是使受精卵恢复正常二倍体倍性以来保证个体的正常发育。现有卵子染色体的二倍体化主要有物理学方法、化学方法和生物学方法三种，无论哪种方法，在多倍体诱导过程中的各种处理（如物理操作或药物残留）对细胞内特定蛋白的生化效应存在一定的伤害，这种伤害常常对诱导物的生长和存活产生一定的负面效应。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作方法简单、快捷，无需卵子染色体加倍处理，可快速、高效生产雌核发育二倍体泥鳅的诱导天然四倍体鱼类雌核发育的方法。

本发明的技术解决方案是：一种诱导天然四倍体泥鳅雌核发育的方法，其特征在于依次按如下步骤进行：

a. 精、卵的获得

取天然雌性四倍体泥鳅及雄性二倍体泥鳅进行催产，分别取雌性四倍体泥鳅的卵子及雄性二倍体泥鳅的精液，所得精液用Kurokura’s solution溶液稀释100倍待用；

b. 精子的遗传失活

将二倍体泥鳅精液均匀铺设于底面涂有厚度为1mm的1%BSA洁净培养皿内，用紫外线照射二倍体泥鳅的精液，照射剂量为50erg/mm2/s×120s；

c. 人工授精

取a步骤所得卵子与经b步骤紫外线照射的二倍体泥鳅的精子授精，授精在避光条件下进行，并在避光状态中孵化15min；

d. 受精卵孵化及培育

将所得受精卵收集在装有淡水的培养皿中孵化，水温23±1℃，每天换水两次，每次换水1/3，待孵化后移入另一培育器皿培育，生产出泥鳅雌核发育二倍体鱼苗。

本发明是以经紫外线灭活的二倍体泥鳅的精子激活天然四倍体泥鳅的卵子，继而培育出雌核发育二倍体泥鳅。因天然四倍体泥鳅是含有四套染色体组的遗传四倍体（4n=100）且是同源四倍体，雌雄泥鳅均能产生正常的2n配子，所以无须卵子加倍处理，操作方法简单、快捷，避免了繁琐的人工处理操作程序及理化诱导手段可能对受精卵造成的伤害, 提高了孵化率等，是实现鱼类雌核发育一条切实可行的途径，具有巨大的应用价值。

附图说明

图1是本发明实施例所制备的雌核发育二倍体泥鳅染色体（2n=50）的图片。

图2是对照组（2n♀× 4n♂）泥鳅染色体（3n=75）的图片。

具体实施方式

依次按如下步骤进行：

a. 精、卵的获得