[发明专利]表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90基因的DNA疫苗及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种DNA疫苗及其构建方法和应用，特别涉及一种表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90基因的DNA疫苗及其构建方法和应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

网状内皮组织增生病（reticuloendotheliosis，RE）是由网状内皮组织增生病病毒（REV）群的反转录病毒引起的禽类的病理综合征，包括急性网状细胞肿瘤形成、矮小综合征和淋巴组织与其它组织慢性肿瘤。

REV属于哺乳动物C型反转录病毒属，基因大小为9.0kb，主要编码核心蛋白（gag）、酶蛋白（pol）和囊膜蛋白（env）。其中env基因编码两种糖蛋白gp90和gp20，gp90为表面蛋白，是病毒的免疫原蛋白，可诱导机体产生中和抗体。RE不仅能引起禽生长迟缓、废弃淘汰率升高和死亡，还能引起免疫抑制，干扰其它禽病疫苗的免疫效应，引起免疫失败，并易继发感染其它禽病，造成巨大的经济损失，现已引起广大研究者的高度重视。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90基因的DNA疫苗及其构建方法和应用。

为了达到以上目的，本发明采用的技术手段为：

本发明的一种表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90基因的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗中含有SEQ ID NO.1所示的序列。

在本发明中，优选的，所述的DNA疫苗是通过将SEQ ID NO.1所示的序列克隆入pCAGGS表达载体中得到的。

进一步的，本发明还提供了一种表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90基因的DNA疫苗的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）根据鸡偏嗜密码子将REV gp90基因进行密码子优化，优化后的REV gp90基因序列如SEQ ID NO.1所示，在优化后的基因两端分别设计酶切位点，合成基因；

（2）将合成的基因克隆到pUC19载体中，构建pUC19-optigp90重组质粒；

（3）将pUC19-optigp90重组质粒进行酶切，获得optigp90基因；

（4）将optigp90基因克隆到用同样酶酶切后的pCAGGS表达载体中，构建得到pCAGoptigp90重组表达质粒，即为所述的DNA疫苗。

在本发明的一个具体实施例中，步骤（1）中所述的酶切位点为EcoRI、ClaI。

在本发明中，更优选的，所述的构建方法还包括对所述重组表达质粒pCAGoptigp90进行提取纯化。

更进一步的，本发明还提供了所述的DNA疫苗在制备治疗或预防禽网状内皮组织增生病药物中的应用。

与传统疫苗相比，本发明DNA疫苗既拥有亚单位疫苗和灭活疫苗的安全性，又具有只有弱毒疫苗或重组疫苗才有的同时诱导体液免疫和细胞免疫应答的特点。

附图说明

图1为重组质粒pCAGoptigp90PCR和酶切鉴定结果；

图2为质粒转染DF-1细胞48h后间接免疫荧光检测结果；

图3为质粒转染DF-1细胞48h后Western blot检测结果；

图4为REV DNA疫苗pCAGoptigp90免疫后各周鸡体内抗体滴度检测结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的保护范围。

实施列1表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90基因的DNA疫苗的构建及表达

1材料和方法

1.1病毒株和细胞

REV HLJR0901株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病课题组分离鉴定并保存。pUC19载体、pCAGGS载体和DF-1细胞由本实验室保存，可通过商业途径购买得到。

1.2仪器与试剂

质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自omega公司；限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自Fermentas公司；紫外分光光度计购自GE公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自invitrogen；RIPA裂解液购自碧云天公司；血液基因组提取试剂盒购自Omega公司；REVgp90单克隆抗体、大肠杆菌感受态Top10F’有本实验室保存。

1.3表达禽网状内皮组织增增病病毒gp90基因的DNA疫苗的构建步骤：