[发明专利]一种SPF蛋外源病毒的检验方法

权利要求书

1.一种SPF蛋外源病毒的检验方法，其特征在于：所述检验方法包括鸡胚检查法和细胞检查法，其中，

鸡胚检查法为：孵化SPF蛋，取9-12日龄鸡胚，并收集尿囊液，用1%鸡红细胞悬液测尿囊液的血凝情况，观察鸡胚是否病变；

细胞检查法为：孵化SPF蛋，取9-12日龄鸡胚细胞进行细胞培养，当细胞培养成单层后分别接种10-15日龄尿囊液和卵黄，盲传二代，观察接种后细胞的病变情况，最后一代培养5-7天，分别取细胞培养所得的尿囊液组细胞和卵黄组细胞做红细胞吸附检验；再分别取细胞培养所得的尿囊液组细胞和卵黄组细胞反复冻融，离心，取上层清液用ELISA试剂盒测淋巴白血病、网状内皮增生症病、鸡传染性贫血病、禽呼肠孤病、禽脑脊髓炎病五种病的抗原，观察检查结果；

判定：若鸡胚检查法检测鸡胚发育正常，鸡胚大小无明显差异，无病变或病痕，红细胞全部无血凝现象；细胞检查法检测尿囊液组细胞和卵黄组细胞无细胞病变，无红细胞吸附现象，同时ELISA试剂盒检测结果均为阴性，则表明被检测的SPF蛋无外源病毒，质量合格；若以上其中一项不合格则判定该批蛋不符合SPF蛋要求。

2.根据权利要求1所述的SPF蛋外源病毒的检验方法，其特征在于：所述鸡胚检查法中用1%鸡红细胞悬液测尿囊液的血凝情况的具体操作为：在微量反应板上，从第1孔至12孔，每孔加入PBS缓冲液0.025ml，每孔加入9-12日龄鸡胚的尿囊液0.025ml，从第1孔起，采用PBS缓冲液依次对尿囊液稀释，稀释倍数依次为2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024、2048、4096，至最后1个孔，弃去0.025ml液体，每孔继续加入1%鸡红细胞悬液0.025ml，以不加样品的红细胞对照孔，然后在微量反应板振摇器上摇匀，置室温40分钟或置2～8℃60分钟，当对照孔中的红细胞呈显著钮扣状时判定结果，以红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。

3.根据权利要求1所述的SPF蛋外源病毒的检验方法，其特征在于：所述细胞检查法的具体操作为：

A、在36-38℃孵化箱中孵化SPF蛋，取9-12日龄鸡胚细胞进行细胞培养，当细胞培养成单层后备用； 

B、然后在无菌条件下收集10-15日龄鸡胚尿囊液，反复冻融3次以上，2-8℃下以4000-6000g的离心力离心10-15分钟，将尿囊液接种到步骤A得到的单层细胞中；

C、无菌条件下收集10-15日龄鸡胚的卵黄，反复冻融3次以上，用生理盐水按卵黄与生理盐水1：3的体积比进行稀释，2-8℃下以4000-6000g的离心力离心10-15分钟，取上层清液接种到步骤A得到的单层细胞中，置37℃吸附60分钟，弃去接种液，用含3%的新生牛血清的MEM培养液继续培养5~7天；

D、盲传二代步骤B和步骤C接种并培养的单层细胞，观察细胞病变情况；

E、步骤D接种的单层细胞最后一代培养5-7天，分别取细胞培养所得的尿囊液组细胞和卵黄组细胞各一瓶，用0.2%鸡红细胞悬液和0.2%豚鼠红细胞悬液等量混合后的混合液做红细胞吸附检验；

F、步骤D接种的单层细胞最后一代培养5-7天，分别取细胞培养所得的尿囊液组细胞和卵黄组细胞反复冻融3次，2-8℃下以4000-6000g的离心力离心10-15分钟，取上层清液，用ELISA试剂盒测淋巴白血病、网状内皮增生症病、鸡传染性贫血病、禽呼肠孤病、禽脑脊髓炎病五种病的抗原。

4.根据权利要求1所述的SPF蛋外源病毒的检验方法，其特征在于：所述经鸡胚检查法和细胞检查法结合进行检查SPF蛋外源病毒后，进行验证的方法为：孵化SPF蛋，取1日龄小鸡采血，分离血清，按国家标准检测SPF蛋的19种病原。