[发明专利]应用嗜糖假单胞菌G4-淀粉酶和其变体获得乙醇的无葡糖淀粉酶的方法

权利要求书

1.加工淀粉的方法，其包括通过添加嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)淀粉酶(PS4)变体而液化淀粉和/或糖化淀粉液化物以形成糖浆，其中所述变体的多肽序列包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，并且其中所述PS4变体至少包含一个在SEQ ID NO：1位置169处的氨基酸替换。

2.权利要求1的方法，其中所述的PS4变体包含与SEQ ID NO：1、SEQID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列。

3.权利要求2的方法，其中所述的PS4变体至少包含一个SEQ ID NO：1的Q169D/E/G/K/N/R/V的氨基酸替换。

4.权利要求1至3任一项的方法，其中所述的PS4变体还包含一个或多个在以下位置处的氨基酸替换：SEQ ID NO：1的26，34，49，104，121，142，157，158，161，200，229，272，276，324，374。

5.权利要求4的方法，其中所述的PS4变体还包含一个或多个在以下位置处的氨基酸替换：SEQ ID NO：1的N26E，N34D，D49V，G104R，G121R，Q142E，L157M，G158T，A161S，P200A，P229S，Q272H，G276R，T324L，A374V。

6.权利要求1的方法，其中与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比较，所述的PS4变体具有改变的热稳定性。

7.权利要求6的方法，其中所述的PS4变体比SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列更热稳定。

8.权利要求1的方法，其中与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比较，所述的PS4变体具有改变的内切淀粉酶活性、改变的外切淀粉酶活性和/或改变的外切淀粉酶活性与内切淀粉酶活性比。

9.权利要求8的方法，其中与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比较，所述的PS4变体具有升高的内切淀粉酶活性或降低的外切淀粉酶活性与内切淀粉酶活性比。

10.权利要求8的方法，其中与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比较，所述的PS4变体具有升高的外切淀粉酶活性或升高的外切淀粉酶活性与内切淀粉酶活性比。

11.权利要求1的方法，其还包括添加脱支酶、异淀粉酶、支链淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、或所述酶的任意组合至所述淀粉液化物。

12.权利要求1的方法，其中所述淀粉来自玉米、玉米穗、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。

13.权利要求1的方法，其还包括发酵所述糖浆以产生乙醇。

14.权利要求13的方法，其还包括回收乙醇。

15.权利要求14的方法，其还包括蒸馏所述淀粉以获得所述乙醇，其中所述的发酵和蒸馏同时、分别或顺次进行。

16.权利要求3的方法，其中在位置Q169的氨基酸替换选自D、E、G、K、N、R、V。

17.嗜糖假单胞菌淀粉酶(PS4)变体，其包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，并且其中所述PS4变体至少包含一个在SEQ ID NO：1位置169处的氨基酸替换。

18.权利要求17的PS4变体，其包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的残基1至429或SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列。