[发明专利]一种模拟重组无痕克隆方法

权利要求书

1.一种模拟重组无痕克隆方法，所述方法包括：

（1）载体DNA制备：以克隆载体质粒为模板，以目的基因插入位点两端的序列为结合位点设计引物，并在引物5’端分别加上与目的基因匹配的长度为20~30bp的序列，所得上游引物记为primer1，下游引物记为primer2，以primer1和primer2为引物进行PCR扩增获得载体DNA； 

（2）目的基因制备：经酶切或扩增获得包含目的基因的片段；

（3）基因重组：将步骤（1）载体DNA和步骤（2）所得片段混合，先加入λ Exonuclease，37℃反应30 min ，72℃温浴5min ，50℃温浴30min，然后温度降至37℃，加入 T4 DNA聚合酶和dNTPs，37℃反应15 min，获得重组DNA。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述目的基因为Sox10基因的编码区，所述方法如下： 

（1）载体DNA制备：以pGEX-4T-1载体质粒为模板，以引物Sox10-pGEX-P1和Sox10-pGEX-P2进行PCR扩增，得到载体DNA；

引物Sox10-pGEX-P1序列如下：

5’- AGGTCTTGTTCCTCGGCCATGAATTCCGGGGATCCACGC -3’；

引物Sox10-pGEX-P2序列如下：

5’- CGACTCTATCCCGACCTTAGCTCGAGCGGCCGCATCGTG -3’；

（2）目的基因制备：包含Sox10 ORF的pBlueScript II KS(-)质粒用内切酶EcoRI-HF和XhoI进行酶切，获得Sox10 ORF酶切片段；

（3）基因重组：将步骤（1）载体DNA和步骤（2）所得片段混合，先加入λ Exonuclease，37℃反应30 min ，72℃温浴5min ，50℃温浴30min，然后温度降至37℃，加入 T4 DNA聚合酶和dNTPs，37℃反应15 min，获得重组DNA。