[发明专利]一种利用毕赤酵母表达系统异源表达活性膜蛋白的方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及基因工程及酶技术领域，更具体地，本发明涉及一种膜蛋白的活性表达、酶学功能及其科研用途。

【背景技术】

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，与其它表达系统相比，毕赤酵母表达系统具有以下优势：1）特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，甲醇可严格地调控外源基因的表达，且甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜；2）表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达；3）发酵工艺成熟，易放大；4）培养成本低，产物易分离；5）外源蛋白基因遗传稳定。一般外源蛋白基因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失；6）作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。

毕赤酵母表达系统PichiaPink^TM相较于普通的巴斯德毕赤酵母系统多了以下的几个优势：利用腺嘌呤营养缺陷型（敲除ADE2基因）进行筛选，避免了抗性筛选的繁琐；敲除蛋白酶pep4和/或prb1基因，减少了目标蛋白的降解；针对不同的蛋白具有不同的载体进行选择，有低拷贝载体、高拷贝载体，和一个带有α-mating signal信号肽基因的高拷贝载体，其中带有信号肽的高拷贝载体pPinkα-HC特别适合于将可溶蛋白分泌至胞外，有利于后期的蛋白纯化，另外也可以保证膜蛋白的定位，以保证其活性发挥，这也避免了将基因在大肠杆菌中重组表达时，因蛋白定位失败而失活的情况。

具有产共轭亚油酸（CLA）的乳酸菌已得到了广泛报道，如：罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、短双歧杆菌和动物双歧杆菌等产CLA的效率很高。动物双歧杆菌BB-12是其中的一种细菌，该菌是现有技术已知的细菌（例如参见：刘勇，张勇，包艳，张和平.4株益生菌的表面特性及抑制致病菌作用研究.中国食品学报.2010.第二期2；王记成，郭壮，闫丽雅，刘小鸣，陈卫，张和平.益生菌Lactobacillus casei Zhang与商业益生菌对胃肠转运耐受性及发酵特性的比较.中国食品学报.2009.第5期），可通过商业购买获得。该菌可将50%的底物亚油酸（LA）转化为CLA，且所产的CLA中具有生物活性的顺9，反11-CLA的含量超过50%。

尽管乳酸菌产共轭亚油酸的国内外文献报道已有很多，但乳酸菌产CLA的机理尚不明确，特别是在催化反应的酶很可能是膜蛋白的情况下，相关的研究进展十分缓慢，利用相关微生物进行大规模生产的进展目前几乎为零，营养学家们正在想方设法扩大共轭亚油酸的产量以便用于医疗或保健食品。

【发明内容】

本发明目的在于根据现有膜蛋白活性表达较困难的问题，对来自于动物双歧杆菌BB-12的肌球蛋白交叉反应（MCRA）提供一种重组的活性表达的方法，所述方法在PichiaPink^TM表达系统中表达动物双歧杆菌BB-12的膜蛋白MCRA。在重组表达双歧杆菌BB-12的肌球蛋白交叉反应（MCRA）抗原的方法时：以动物双歧杆菌BB-12基因组为模板，以5’-CCGGATATCATGGACACTAGGGCGCCGAAAGTCG-3’，5’-CGGGGTACCTCAGTGATGGTGATGGTGATGTTTCGCCGAATCATTCTCCCCCG-3’为引物，通过高保真PCR扩增的方法得到MCRA蛋白的编码基因。在得到MCRA蛋白的编码基因后，将编码基因与具有信号肽的载体pPinkα-HC连接得到pPinkα-HC-MCRA质粒，然后用pPinkα-HC-MCRA质粒转化PichiaPink^TM，转化成功的PichiaPink^TM菌表达动物双歧杆菌BB-12的膜蛋白MCRA。

本发明的另一目的还涉及一种重组表达双歧杆菌BB-12的肌球蛋白交叉反应（MCRA）抗原的宿主，该宿主为pPinkα-HC-MCRA质粒转化的PichiaPink^TM菌，其中的pPinkα-HC-MCRA质粒是将双歧杆菌BB-12的MCRA编码基因与具有信号肽的载体pPinkα-HC连接得到的。

本发明另一个目的在于提供上述膜蛋白或活性表达系统的应用，可以将获得的双歧杆菌BB-12肌球蛋白交叉反应（MCRA）抗原或宿主用于制备共轭亚油酸。

本发明上述目的是通过以下技术方案予以实现：