[发明专利]靶向HIV-1特异siRNA生物纳米粒及其制备和应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种具有HIV-1特异基因沉默作用的siRNA生物纳米粒，本发明还涉及所述生物纳米粒的制备方法，以及在制备防治艾滋病药物方面的应用。 

背景技术：

基因治疗是当前艾滋病治疗的新方法。RNA干扰（RNA interference，RNAi）又称为依赖于RNA的基因沉默机制，是通过双链RNA（double-strand RNA，dsRNA）特异性地抑制与其序列同源的靶基因mRNA表达的现象。即在胞质中，双链RNA引发了同源mRNA的降解，故也被称为转录后基因沉默现象（post-transcriptional gene-silencing，PTGS）。 

RNAi治疗AIDS的研究现状 

siRNAs或miRNAs可以特异地结合靶mRNA，引起靶mRNA降解或翻译抑制，最终导致基因特异性沉默。RNAi技术很可能为抗HIV治疗的研究打开突破口。 

基因沉默靶点的确立 

HIV-1基因组编码区由9个开放读框组成，包括3个结构基因（gag、pol、env），2个调节基因（tat、rev）和4个辅助基因（vif、vpr、vpu、nef）。非结构基因曾被认为不是HIV-1病毒复制所必需的“非必需基因”，但是近年来越来越多的研究表明HIV-1的非结构基因在病毒的致病机理、感染性、潜伏上都有着重要的作用，因此本发明将非结构基因作为抗病毒治疗的靶点。HIV-1Tat蛋白不仅参与反式激活病毒的表达，还参与AIDS相关疾病的病理机理，如神经毒性作用、致癌原性、免疫抑制原性等，在HIV-1的病毒复制及致病中都起了重要的作用。Rev蛋白可以与Rev应答元件（Rev response element,RRE）结合，介导未拼接和不完全拼接的mRNA从胞核向胞浆内的转运，促进病毒结构蛋白和酶的合成，引发HIV基因表达由早期向晚期的转换。Vpr可以在病毒复制的早期，反式激活HIV-1LTR，促进病毒基因的表达；介导和增强整合前复合体的核转运；改变细胞基因的表达，诱导细胞周期G2/M期阻滞及细胞凋亡。病毒感染因子（Viral Infectivity Factor，Vif）可以抵抗载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(human protein apoliproteinB mRNA-editing enzyme-catalytic polypeptide-like-3G，APOBEC3G)的抗病毒活性， 增强HIV-1毒粒的感染力。 

研究显示，HIV的gag和nef基因均可以通过RNAi进行沉默，RNAi方法治疗艾滋病已经成为艾滋病治疗研究的热点，研究显示通过RNAi方法可以阻止HIV感染及抑制HIV复制。但其技术本身仍存siRNA稳定性差、容易降解、无靶向性等问题。以重组病毒载体方式导入的siRNA虽然稳定性较高，但是又带来导入效率及载体基因整合等问题。 

人间充质干细胞（Human Mesenchymal Stem Cells,hMSC）具有多向分化潜能，自身免疫原性低，取材方便。目前美国FDA已经批准其用于自身免疫疾病及基因治疗载体等多个方面的临床试验。 

发明内容:

本发明的目的是筛选出针对HIV-1非结构基因vpr，tat，vif，rev具有基因沉默作用的siRNAs序列，并将这些siRNAs序列构建到慢病毒载体，在干细胞及其他传代细胞中进行表达，制备一种含有对HIV特异性沉默的siRNA的生物颗粒，以用于制备预防和治疗艾滋病的药物。 

本发明提供了一种靶向HIV-1特异性siRNA慢病毒为载体间充质干细胞内表达的siRNA生物纳米粒，经体外HIV活病毒攻击实验证实，可用于艾滋病毒的感染者和艾滋病患者的治疗。 

本发明有如下创新点： 

其一，本发明首次发现了可使HIV-1非结构基因vpr，tat，vif，rev基因沉默的6个siRNAs序列 

本发明人针对HIV-1病毒基因组的vpr，tat，rev，vif基因的保守区域设计了14条干扰RNA序列，经实验筛选，发现其中以下6条siRNA序列可以特异地靶向HIV-1vpr，tat，vif，rev： 

其二，本发明构建了含有HIV env基因的重组慢病毒载体，筛选到能够稳定表达HIV跨膜蛋白gp120和gp41的hMSC-env细胞系。 

该细胞系的名称为XXXX，已于年月日保藏于XXXX，保藏号为XXXX