[发明专利]非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法

权利要求书

1.一种非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于包括以下步骤：

A、根据副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因设计引物对；

B、提取样本DNA后，利用设计的引物对进行非标记荧光PCR扩增；

C、应用带HRM模块的荧光PCR仪软件对PCR扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，确定扩增产物的Tm值熔解曲线图谱。

2.根据权利要求1所述非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于所述引物对的上游引物序列为：5‘-AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3’，所述引物对的下游引物序列为：5‘-TGTGCCTTGATGAACTCGTTC-3’。

3.根据权利要求1所述非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于步骤B中所述非标记荧光PCR扩增过程是在反应液中进行的，其中制备20μL的反应液由以下组分组成：

4.根据权利要求3所述非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于所述的荧光染料为DNA饱和性染料。

5.根据权利要求4所述非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于所述的DNA饱和性染料为Eva Green染料、LCPLUS染料、SYTO 9染料中的一种或两种以上的混合物。

6.根据权利要求3所述非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于所述dNTP混合液由10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP组成的混合液。

7.根据权利要求1或3所述非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于步骤B中非标记荧光PCR扩增的扩增反应按以下步骤进行：

（1）92℃～96℃预变性30s；

（2）92℃～96℃变性10～30s,55-63℃退火10～30s,72℃10～30s,共进行40～50个循环；

（3）72℃延伸10～30s。

8.根据权利要求1所述非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于步骤C中对PCR扩增产物高分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行：

（1）92℃～96℃变性1min；

（2）40℃复性1min；

（3）然后初始熔解温度60～65℃，开始程序升温熔解至95℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。